虎杖苷對K562細胞增殖及凋亡的影響

羅　源，王春美，朱相展，盛光耀#

1)鄭州大學第一附屬醫院兒科 鄭州 450052　2)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

虎杖苷對K562細胞增殖及凋亡的影響

羅源1)，王春美1)，朱相展2)，盛光耀1)#

1)鄭州大學第一附屬醫院兒科 鄭州 4500522)鄭州大學生命科學學院 鄭州 450001

關鍵詞虎杖苷；K562細胞；Akt/mTOR/p70S6K；凋亡

摘要目的：觀察虎杖苷對白血病細胞株K562細胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能機制。方法：以不同濃度(0、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L)虎杖苷處理K562細胞12、24、48 h后，采用CCK-8法檢測細胞增殖抑制率。另取對數生長期的K562細胞，分為3組，觀察組加入80 μmol/L的虎杖苷，陰性對照組加入DMSO，空白對照組不處理，培養24 h后，采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡，流式細胞儀檢測細胞周期，Western blot檢測p-Akt、p-mTOR、p70S6K、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達水平。結果：虎杖苷能有效抑制K562細胞增殖，呈時間和劑量依賴性(P<0.001)。80 μmol/L虎杖苷作用24 h后，K562細胞凋亡率增加(P<0.001)；細胞周期出現G0/G1期至S期的阻滯(P<0.001)；p-Akt、p-mTOR、p70S6K、Bcl-2蛋白表達水平下降(P<0.05)，Bax、Caspase-3蛋白表達水平升高(P<0.05)。結論：虎杖苷可有效抑制K562細胞增殖并誘導其凋亡，可能是通過抑制Akt/mTOR/p70S6K信號通路及調控相關凋亡蛋白的表達來實現的。

虎杖苷(polydatin,PD)又名白藜蘆醇苷，是從蓼科蓼屬虎杖(PolygonumCuspidatum)的干根莖中提取的第4種單體，故又名虎杖結晶4號。現代藥理學研究[1-2]表明，白藜蘆醇及其自然前體虎杖苷在抗血小板聚集及血栓形成、加強心肌細胞收縮和舒張功能、改善休克后重要組織器官的微循環等方面有顯著作用。近年研究[3-4]發現，虎杖苷可有效抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡，但大都是有關實體瘤的研究。該研究擬以人慢性粒細胞白血病細胞株K562為研究對象，觀察虎杖苷對K562細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響，并探討可能的機制。

1材料與方法

1.1材料K562細胞株(購自中國科學院上海細胞研究所，鄭州大學醫學檢驗系血液實驗室保存)，虎杖苷(美國Sigma公司)，RPMI 1640培養基(美國HyClone公司)，標準胎牛血清(FBS,美國Gibco公司)，DMSO(上海索寶生物科技有限公司)，p-Akt、p-mTOR、p70S6K單克隆抗體(FBS,美國CST公司)，GAPDH、Bcl-2、Bax多克隆抗體、細胞全蛋白提取試劑盒[生工生物工程(上海)有限公司]，Caspase-3多克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒(美國BD公司)。虎杖苷溶解于DMSO配制成10 mmol/L貯存液，避光保存于-20 ℃冰箱，待用時用RPMI 1640稀釋至相應濃度。

1.2細胞培養K562細胞使用含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素及0.5 mmol/L 2-巰基乙醇的RPMI 1640培養基于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱內培養，1～2 d傳代1次，取處于對數生長期的細胞進行以下檢測。

1.3細胞增殖檢測收集處于對數生長期的K562細胞，調整細胞密度至5×104mL-1，接種于96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液培養過夜，分別加入0、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L的虎杖苷溶液10 μL作為實驗組，以加入相同體積DMSO K562細胞作為陰性對照，以不含細胞的完全培養基作為空白對照，每組設置3個平行復孔；分別處理12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，室溫孵育4 h后，用酶標儀于450 nm波長處讀取各孔的吸光度(A)值。抑制率=[(A陰性對照孔-A實驗孔)/(A陰性對照孔-A空白對照孔)]×100%。實驗重復3次。選取最佳時間藥物濃度用于后續實驗。

1.4細胞凋亡檢測取對數生長期的K562細胞，接種于6孔板。分為3組，觀察組加入80 μmol/L的虎杖苷溶液，陰性對照組加入等體積的DMSO，空白對照組不處理，每組設3個平行復孔。培養24 h后，離心收集細胞并調整密度為1×106mL-1。取1 mL細胞懸液，用PBS洗2次，分別加入100 μL Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后，室溫避光反應15 min，隨后加入500 μL Binding Buffer，1 h內避光上機檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.5細胞周期檢測取對數生長期的K562細胞，同1.4中分組處理后，離心收集不同處理組的K562細胞，調整細胞密度為2×105mL-1，取1 mL細胞懸液，PBS清洗1～2遍，加入450 μL PBS重懸細胞，隨后加入到1 mL預冷的體積分數70%的乙醇中，4 ℃過夜固定；離心棄去乙醇，PBS清洗1～3遍；加入500 μL 50 mg/L RNase A/PI孵育液，室溫避光放置15 min后用流式細胞儀檢測細胞周期。實驗重復3次。

1.7統計學處理采用SPSS 21.0處理數據。采用3×7析因設計的方差分析觀察不同劑量的虎杖苷作用不同時間對K562細胞增殖的影響；采用單因素方差分析比較3組K562細胞周期、凋亡及相關蛋白表達的差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1虎杖苷對K562細胞增殖的影響結果見表1。由表1可見，虎杖苷可有效抑制K562細胞增殖，且呈劑量和時間依賴性。虎杖苷作用24 h的半數抑制濃度(IC50)約為80 μmol/L，因此選擇80 μmol/L虎杖苷作用于K562細胞24 h用于后續實驗。

表1　虎杖苷對K562細胞的增殖抑制率　%

F時間=187.014，F濃度=726.164，F交互=201.568，P均<0.001。

2.2虎杖苷對K562細胞凋亡的影響Annexin-FITC/PI雙染法結果提示：80 μmol/L虎杖苷處理24 h的觀察組細胞凋亡率為(14.78±0.30)%， 空白對照組為(2.16±0.44)%，陰性對照組為(2.90±0.60)%，3者相比，差異有統計學意義(F=705.028，P<0.001)；觀察組細胞凋亡率高于空白對照組及陰性對照組(P<0.05)。

2.3虎杖苷對K562細胞周期的影響結果見表2。由表2可知，與空白對照組及陰性對照組相比，80 μmol/L虎杖苷處理24 h的觀察組出現G0/G1期至S期的阻滯。

表2　虎杖苷對K562細胞周期的影響　%

*：與其他2組相比，P<0.001。

2.4虎杖苷對Akt/mTOR/p70S6K信號通路關鍵因子及凋亡相關蛋白表達的影響Western blot檢測結果見圖1、表3。由表3可知，經過80 μmol/L 虎杖苷處理24 h后，K562細胞中p-mTOR、p70S6K、p-AKT表達下調，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，而凋亡蛋白Bax、Caspase-3活性增強。

1:空白對照組;2: 陰性對照組;3:觀察組。圖1　3組細胞多種蛋白的表達

組別np-mTORp70S6Kp-AKTBcl-2BaxCaspase-3空白對照組30.90±0.080.42±0.100.87±0.050.88±0.030.27±0.040.58±0.05陰性對照組30.89±0.030.46±0.150.85±0.070.86±0.020.26±0.050.60±0.06觀察組30.23±0.09*0.08±0.04*0.29±0.03*0.55±0.07*0.44±0.02*0.86±0.05*F85.60611.718133.85258.06018.50327.722P<0.0010.008<0.001<0.0010.0030.001

*：與其他2組相比，P<0.05。

3討論

虎杖苷是白藜蘆醇與葡萄糖結合的產物，這一結合使得白藜蘆醇的分子構象發生改變，從而導致生物學特性也發生改變。與白藜蘆醇相比，虎杖苷更容易被吸收，更能耐受酶的氧化作用；白藜蘆醇不溶于水，而虎杖苷可溶于熱水；白藜蘆醇通過被動轉運進入細胞，而虎杖苷則可利用葡萄糖載體通過主動轉運的方式進入細胞內。這些特性的改變有可能使得虎杖苷具有比白藜蘆醇更高的生物活性[5]。現代藥理學研究[6-8]表明虎杖苷在保護心肌細胞、血管平滑肌細胞，抗血小板聚集，改善微循環等方面有顯著作用，此外還能減輕多種因素造成的組織器官損傷，具有保護肝細胞，降血脂及抗脂質過氧化等作用。在抗腫瘤作用方面，虎杖苷對惡性腫瘤細胞包括乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231，肺癌A549、NCI-H1975，宮頸癌HeLa，卵巢癌SKOV-3，肝癌SM7721，鼻咽癌CNE-1，腎細胞癌7860均具有明顯的生長抑制作用，且呈劑量和時間-效應關系[3，9-10]。

該研究首先采用CCK-8法檢測不同劑量的虎杖苷作用不同時間對K562細胞增殖的抑制作用，結果發現虎杖苷能夠有效抑制其增殖，作用呈劑量和時間依賴性，作用24 hIC50為80 μmol/L。用80 μmol/L虎杖苷處理K562細胞24 h后，細胞凋亡率明顯升高，細胞周期被阻滯在G0/G1期。

Akt/mTOR/p70S6K通路是PI3K家族介導的重要信號傳導通路之一，該通路的激活參與了多種腫瘤細胞的增殖、分化和遷移等的調節，且與腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性密切相關，故作用于該信號通路各靶點抑制劑的研究逐漸成為人們關注的熱點，而mTOR是通路中的關鍵因子，已證實mTOR靶向抑制劑雷帕霉素對多種腫瘤細胞具有增殖抑制作用[11-14]。該研究結果顯示，80 μmol/L虎杖苷處理K562細胞24 h后，該通路中p-mTOR、p-Akt及下游p70S6K表達水平降低，證明虎杖苷對Akt/mTOR/p70S6K通路有抑制作用。

既往研究[15]證明，在細胞凋亡過程中，Bcl-2家族發揮著重要調控作用。其中，抗凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax是Bcl-2家族中最重要的凋亡相關基因，二者在腫瘤細胞凋亡中發揮著舉足輕重的作用。同時，Caspase-3是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的關鍵因子，也是凋亡的關鍵酶和執行者[16]。該研究結果顯示，虎杖苷可抑制Bcl-2的表達，并促進Bax及Caspase-3的表達。

綜上所述，虎杖苷能夠有效抑制K562細胞增殖并促進細胞凋亡，將細胞阻滯在G0/G1期，初步推斷虎杖苷能夠通過調節Akt/mTOR/p70S6K信號通路發揮作用，該研究結果為闡明虎杖苷防治白血病的作用機制提供了實驗依據。

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(2015-08-31收稿責任編輯徐春燕)

Effect of polydatin on cell proliferation and apoptosis of leukemia cell line K562

LUOYuan1)，WANGChunmei1)，ZHUXiangzhan2)，SHENGGuangyao1)

1)DepartmentofPediatrics，theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordspolydatin;K562 cell;Akt/mTOR/p70S6K;apoptosis

AbstractAim: To investigate the effect of polydatin on the cell proliferation and apoptosis of leukemia K562 cell line and to study its related molecular mechanism.Methods: Ⅰ:After treatment with different concentrations(0，5，10，20，40，80，160，320 μmol/L) of polydatin for 12, 24, 48 h, the proliferation rate of K562 cells was tested by CCK-8 assay. Ⅱ:K562 cells were allocated into 3 groups,the observation group and negative control group were treated with 80 μmol/L polydatin and DMSO,respectively,and blank control group was not treated.After 24 h, the apoptosis and cell cycle of K562 cells were detected by Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry, respectively. The protein expressions of p-Akt，p-mTOR，p70S6K，Bcl-2，Bax and Caspase-3 were detected by Western blot.Results: The proliferation rate of K562 cells was inhibited by polydatin in a time- and dose-dependent manner(P<0.001). After 24 h treatment with 80 μmol/L polydatin, the apoptosis rate of K562 cells increased(P<0.001),and there was an increase in G0/G1 phase cells and a decrease in S phase cells(P<0.001); polydatin could down-regulate the expressions of p-Akt,p-mTOR,p70S6K,and Bcl-2 and up-regulate the expressions of Bax and Caspase-3(P<0.05).Conclusion: Polydatin could effectively inhibit proliferation and induce apoptosis of K562 cells, which may be via inhibiting the Akt/mTOR/p70S6K signaling pathway and regulating the expressions of apoptosis related proteins.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.027

#通信作者，男,1952年7月生，碩士，教授，研究方向：兒科血液病學，E-mail：shenggy2959@126.com

中圖分類號R733.7