三磷酸腺苷酶家族蛋白2過表達作為胃癌預后標志物可行性研究

黃國全，孫建華，吳泉峰(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院胃腸外科，湖北 恩施 445000)

三磷酸腺苷酶家族蛋白2過表達作為胃癌預后標志物可行性研究

黃國全，孫建華，吳泉峰
(湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院胃腸外科，湖北 恩施 445000)

目的 探討三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATAD2)表達與胃癌患者疾病預后關系。方法 采用定量PCR方法檢測15例新鮮胃癌組織和臨近非腫瘤組織中ATAD2 mRNA表達情況，采用免疫組織化學方法檢測166例胃癌組織石蠟包埋樣本中ATAD2表達情況，分析ATAD2表達與166例胃癌患者疾病臨床病理學特征的關系。結果 與臨近非腫瘤組織比較，胃癌組織中ATAD2 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P< 0.001)。腫瘤臨床分期、腫瘤侵襲深度、淋巴結轉移及遠處轉移為影響胃癌組織ATAD2過表達的顯著性因素。生存分析結果顯示，ATAD2過表達是胃癌患者疾病預后不良的獨立預后因素(P< 0.001)。結論 ATAD2過表達胃癌患者的總生存率低于低表達患者，ATAD2過表達可以作為胃癌患者疾病預后生物標志物。

三磷酸腺苷酶家族蛋白2；胃癌；預后；生物標志物

胃癌在腫瘤性疾病中發病率僅次于肺癌、乳腺癌和結腸直腸癌，死亡率僅次于肺癌[1]，中國的胃癌患者約占全球的33%[2～4]。研究表明，美國2015年胃癌新發病例24590例，胃癌死亡患者10720例[5]。大多數胃癌患者在確診后均被診斷為局部或遠處轉移，且一半胃癌患者手術切除后會復發[6]。因此，臨床上尋找一種與胃癌患者臨床病理學特性相關的疾病預后標志物十分有必要。本研究檢測胃癌組織中三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATPase family，AAA domain containing 2，ATAD2)mRNA和蛋白表達情況，分析其表達與胃癌患者臨床病理學特征的關系，以評估ATAD2表達作為胃癌患者疾病預后生物標志物的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2004～2008年在我院腫瘤科治療的166例胃癌患者，男104例，女62例，術中采集胃癌及臨近非腫瘤樣本并浸于石蠟中。其中15例新鮮臨床樣本為醫院新近接收的胃癌患者，術中采集臨床樣本并采用液氮浸泡后提取總RNA。166例胃癌患者術后隨訪8年，通過查閱病歷獲取患者一般資料見表1。所有患者均為首次發病，入組前均采用其它方法進行治療。本研究通過我院倫理委員會審批，患者知情并同意。

1.2 定量PCR檢測 采用TRIzoI試劑(Takara，日本)提取15例新鮮樣本的總RNA，按照Prime ScriptTM逆轉錄試劑盒操作說明制備cDNA。通過SYBR Premix Ex TaqTM II(RR820，日本)測定樣本中ATAD2基因拷貝數。引物序列及操作方法參考文獻[7，8]。

1.3 免疫組織化學檢測 采用免疫組織化學染色方法檢測166例石蠟包埋胃癌樣本中ATAD2蛋白表達情況，切片厚度為4 μm，采用二甲苯脫石蠟和脫水，采用過氧化氫來滅活內源性過氧化物酶活性，之后浸入10%濃度的脫脂奶中，37 ℃封閉30 min。切片放入小鼠抗人ATAD2單克隆抗體(1∶3000稀釋，Abcam公司，美國)中，4 ℃冰箱孵育過夜，次日，采用PBST反復洗滌，放入親和素標記的山羊抗小鼠IgG二抗中，反復洗滌，加入標記HRP的生物素，孵育20 min，完成上述步驟后加入DAB進行顯色。

表1 ATAD2表達與胃癌患者臨床病理學特征

1.4 評價標準 組織切片的ATAD2蛋白免疫組織化學染色結果由兩位對患者臨床資料不了解的病理學家進行評分：①按照染色強度分成0分(染色陰性)，1分(弱陽性)和2分(強陽性)。②根據陽性細胞計數結果分為0分(0～5%)，1分(5%～20%)，2分(21%～50%)和3分(>51%)。免疫組織化學染色最終結果由上述兩部分結合而成[20]，總分0～6分，≥3分為高表達，<3分為低表達。

1.5 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據處理。計數資料比較采用卡方檢驗；等級資料比較采用Wilcoxon檢驗；生存情況分析采用Kaplan-Meier曲線和單一與多重變量Cox線性回歸分析。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織ATAD2 腫瘤細胞的胞質和胞核中均有ATAD2表達，其中胞核中表達強度顯著高于胞質(圖1)。mRNA與蛋白過表達情況 采用定量PCR方法檢測15例胃癌腫瘤組織和臨近非腫瘤組織ATAD2表達情況，結果表明胃癌組織中ATAD2表達水平顯著高于臨近非腫瘤組織(圖2)。采用免疫組織化學方法檢測166例胃癌石蠟包埋樣本中ATAD2蛋白表達情況，結果顯示腫瘤樣本中有51.8%為ATAD2高表達，而在臨近非腫瘤組織中僅有18.7%的樣本為高表達，差異有統計學意義(χ2=7.19，P= 0.005)，見表2。

圖1 免疫組織化學染色檢測胃癌組織ATAD2表達 a：臨近非腫瘤組織樣本中陰線對照；b：臨近非腫瘤組織樣本中弱陽性樣本；c：胃癌組織中陰性樣本；d：胃癌組織中弱陽性樣本；e：胃癌組織中中等表達樣本；f：胃癌組織中強陽性樣本

圖2 定量PCR檢測15例新鮮胃癌樣本及臨近非腫瘤組織

表2 166例胃癌樣本與臨近非腫瘤樣本中ATAD2表達情況 [n(%)]

2.2 胃癌患者ATAD2過表達的臨床意義 采用Kaplan-Meier曲線進行生存分析發現，166例胃癌患者中ATAD2過表達患者的總生存率低于低表達患者，差異有統計學意義(P<0.001)(圖3)。調整臨床分期、腫瘤侵襲深度、淋巴結轉移和遠處轉移因素的多變量分析結果表明，ATAD2過表達是胃癌患者疾病預后的獨立因素，見表3。

圖3 ATAD2表達與胃癌患者疾病總生存期分析

表3 166例患者單一與多重變量Cox回歸分析

3 討論

ATAD2是AAA+ATPase家族成員[9]，包含兩個ATPase相關細胞活性域，均為雌激素受體共激活劑[10]。ATAD2基因位于基因組8q24，該區域為癌癥基因活躍區，ATAD2直接參與原癌基因的調節，例如ACTR、AIB1和SRC-3。已有研究表明ATAD2通過調節細胞分化、增殖、轉移、凋亡和細胞周期，進而參與腫瘤發生[11，12]。近幾年，多篇文獻報道了ATAD2基因在不同種類組織中表達的臨床意義，例如乳腺癌[13～16]、肝癌[11，17，18]、淋巴瘤[15，19]、子宮內膜癌[20，21]、卵巢癌[22]和肺癌[23]等。然而，ATAD2表達對胃癌患者疾病預后價值臨床研究較少。

ATAD2蛋白空間結構預測結果表明，其含一個肩部域和ATPase域，其基因位于癌癥基因活動頻繁的染色體8q24區域[8]。ATAD2結果表明其主要參與遺傳基因調節，包括細胞增生、分化和凋亡。在乳腺癌細胞中，ATAD2為雌激素作用靶點，且是雌激素介導的細胞增生和細胞周期發展所必須的[7]。有意思的是ATAD2也是雄激素依賴的前列腺癌細胞增殖和存活所必須的[24]。除采用雌激素和雌激素受體途徑外，ATAD2也是連接E2F和MYC途徑所的主要成分，通過增強MYC依賴的轉錄促進腫瘤的侵襲[8，14]。

早期Zou等采用基因芯片分析過乳腺癌細胞表達ACTR時，意外發現ATAD2基因表達升高[7]。此后，大量研究報道ATAD2在多種腫瘤細胞中過表達，例如乳腺癌[14]、宮頸癌[10]、神經膠質瘤[9]、肝細胞癌[11]和卵巢癌[20]。本研究結果與上述研究報道一致，與臨近非腫瘤組織相比，胃癌組織中ATAD2表達顯著升高。

盡管大量文獻分析了ATAD2過表達與多種腫瘤患者臨床病理學特征的關系，而較少見到關于其在胃癌中的報道。為檢測ATAD2蛋白在胃癌患者中表達的意義，本研究采用免疫組織化學染色方法檢測了166例胃癌樣本中ATAD2表達情況，并探討其表達與胃癌患者臨床病理學特征的關系。結果提示ATAD2蛋白過表達與臨床分期、腫瘤侵襲深度、淋巴結轉移及遠處轉移呈正相關關系。這一結果與Zhang等在肺癌的研究結果一致，此外，其研究結果還提示ATAD2過表達還與肺癌患者腫瘤分化、腫瘤大小有關[19]。Wan等檢測ATAD2在110例卵巢癌中表達情況，結果證實其表達與患者腫瘤分期，網膜轉移、腹水及CA125等密切相關[20]。此外，通過基因敲除卵巢癌細胞系ATAD2基因，結果表明其生長顯著抑制[20]。

本研究結果提示，胃癌患者ATAD2過表達時其基本總生存期預后不良，多重變量分析結果表明，ATAD2過表達是胃癌患者疾病預后不良的獨立因素。這一結果與Fellenberg等報道一致，其研究證實ATAD2過表達的骨肉瘤患者疾病總生存期顯著短于低表達患者[25]。此外，Kalashnikova等檢測185例乳腺癌樣本中ATAD2表達情況發現，ATAD2過表達與腫瘤分期相關，且過表達患者疾病臨床預后不良[14]。

總之，本研究結果證實胃癌組織中ATAD2 mRNA和蛋白過表達，且與患者臨床分期、腫瘤侵襲深度、淋巴結轉移和遠處轉移有關，且ATAD2過表達是胃癌患者疾病預后的獨立因素。

[1] Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2015，65(2)：87-108.

[2] Ye YW，Dong RZ，Zhou Y，et al.Prognostic analysis of familial gastric cancer in Chinese population[J].J Surg Oncol，2011，104(1)：76-82.

[3] 薛華，孫亞偉，王一波.基質金屬蛋白酶-2在胃癌組織中的表達及與腹膜擴散的關系[J].實用醫院臨床雜志，2012，9(2)：63-64.

[4] Chen W，Zheng R，Zhang S，et al.The incidences and mortalities of major cancers in China[J].Chin J Cancer，2013，32(3)：106-112.

[5] Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin.2015；65(1)：5-29.

[6] Pasechnikov V，Chukov S，Fedorov E，et al.Gastric cancer：prevention，screening and early diagnosis[J].WJG，2014，20(38)：13842-13862.

[7] Zou JX，Revenko AS，Li LB，et al.ANCCA，an estrogenregulated AAA ？ ATPase coactivator for ERalpha，is required for coregulatory occupancy and chromatin modification[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，104(46)：18067-18072.

[8] 陳艷，嚴必中，陳平，等.胃癌患者乳腺癌易感基因1與X射線修復交叉互補基因1的表達及其奧沙利鉑輔助化療效果分析[J].實用醫院臨床雜志，2016，10(1)：38-40.

[9] Leachman NT，Brellier F，Ferralli J，et al.ATAD2B is a phylogenetically conserved nuclear protein expressed during neuronal differentiation and tumorigenesis[J].Dev Growth Differ，2010，52(9)：747-755.

[10]Zheng L，Li T，Zhang Y，et al.Oncogene ATAD2 promotes cell proliferation，invasion and migration in cervical cancer[J].Oncol Rep，2015，33(5)：2337-2344.

[11]Wu G，Liu H，He H，et al.miR-372 down-regulates the oncogene ATAD2 to influence hepatocellular carcinoma proliferation and metastasis[J].BMC Cancer，2014，14：107.

[12]Boussouar F，Jamshidikia M，Morozumi Y，et al.Malignant genome reprogramming by ATAD2[J].Biochim Biophys Acta，2013，1829(10)：1010-1014.

[13]Salhia B，Kiefer J，Ross JT，et al.Integrated genomic and epigenomic analysis of breast cancer brain metastasis[J].PLoS One，2014，9(1)：e85448.

[14]Kalashnikova EV，Revenko AS，Gemo AT，et al.ANCCA/ATAD2 overexpression identifies breast cancer patients with poor prognosis，acting to drive proliferation and survival of triple-negative cells through control of B-Myb and EZH2[J].Cancer Res，2010，70(22)：9402-9412.

[15]Caron C，Lestrat C，Marsal S，et al.Functional characterization of ATAD2 as a new cancer/testis factor and a predictor of poor prognosis in breast and lung cancers[J].Oncogene，2010，29(37)：5171-5181.

[16]Hsia EY，Kalashnikova EV，Revenko AS，et al.Deregulated E2F and the AAA ？ coregulator ANCCA drive proto-oncogene ACTR/AIB1 overexpression in breast cancer[J].MCR，2010，8(2)：183-193.

[17]Wu G，Lu X，Wang Y，et al.Epigenetic high regulation of ATAD2 regulates the Hh pathway in human hepatocellular carcinoma[J].Int J Oncol，2014，45(1)：351-361.

[18]劉莉，姜勇，李麗，等.人表皮生長因子受體-2在胃癌組織中的表達及意義[J].實用醫院臨床雜志，2012，9(5)：155-157.

[19]Zhang Y，Sun Y，Li Y，et al.ANCCA protein expression is a novel independent poor prognostic marker in surgically resected lung adenocarcinoma[J].Ann Surg Oncol，2013，20(Suppl 3)：S577-582.

[20]Wan WN，Zhang YX，Wang XM，et al.ATAD2 is highly expressed in ovarian carcinomas and indicates poor prognosis[J].APJCP，2014，15(6)：2777-2783.

[21]Wrzeszczynski KO，Varadan V，Byrnes J，et al.Identification of tumor suppressors and oncogenes from genomic and epigenetic features in ovarian cancer[J].PLoS One，2011，6(12)：e28503.

[22]Raeder MB，Birkeland E，Trovik J，et al.Integrated genomic analysis of the 8q24 amplification in endometrial cancers identifies ATAD2 as essential to MYC-dependent cancers[J].PLoS ONE，2013，8(2)：e54873.

[23]馬懿，盧漫，蔡志清，等.應用胃充盈超聲檢查對胃癌術前TNM分期的臨床研究[J].實用醫院臨床雜志，2012，9(4)：63-66.

[24]鄭樂，李天人，姚霽航，等.三磷酸腺苷酶家族蛋白2研究進展[J].中國腫瘤，2016，25(5)：371- 374.

[25]趙文思，羅弋，黎博一，等.三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2特異性人源肺癌噬菌體單鏈抗體的篩選和鑒定[J].第三軍醫大學學報，2015，23(5)：2343-2347.

ATAD2 over-expression is an independent poor prognostic biomarker for patients with gastric cancer

HUANGGuo-quan，SUNJian-hua，WUQuan-feng
(DepartmentofGastrointestinalSurgery，CentralHospitalofEnshiTujia-MiaoAutonomousPrefecture，Enshi445000，China)

Objective To investigate the prognostic value of expression of ATPase family AAA domain containing 2 (ATAD2) in patients with gastric cancer.Methods qRT-PCR was used to quantitatively detect the ATAD2 mRNA expression in 166 samples of fresh cancer and para-carcinoma tissues. Immunohistochemistry was used to examine ATAD2 protein expression in 166 paraffin-embedding samples. The relationship between clinicopathological features and ATAD2 expression was analyzed.Results The expression of ATAD2 mRNA and protein in gastric cancer samples were significantly higher than that in normal tissues (P< 0.001). ATAD2 over-expression was highly correlated with cancer clinical stage，tumor depth，lymph node metastasis and distant metastasis. According to our survival analysis，ATAD2 protein over-expression was a poor independent prognostic factor for patients with gastric cancer (P< 0.001).Conclusion ATAD2 could be used as a prognostic biomarker for patients with gastric cancer.

Gastric cancer，Prognosis；ATAD2；Biomarker

孫建華

R735.2

A

1672-6170(2016)06-0029-05

2016-01-09；

2016-06-24)