RFLP技術在作物育種中的應用與展望

■高　欣　藺　娜

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RFLP技術在作物育種中的應用與展望

■高欣藺娜

內容摘要：分子標記技術（簡稱MAS）已在人類、動物、植物以及微生物中得到了廣泛應用，在眾多的MAS技術中，RFLP是最早也是應用最為廣泛的一種分子標記。為了更深入的了解RFLP技術及其發展方向，對德溫特世界專利索引數據庫（DWPI）中涉及利用該技術進行植物育種的相關專利進行了分析和研究，梳理了該技術的發展脈絡以及研究現狀，對于該技術未來的發展前景和展望，還有待于進一步的深入研究和分析。

關鍵詞：分子標記RFLP專利分析

分子標記技術（簡稱MAS）誕生于20世紀80年代，目前已在人類、動物、植物以及微生物中得到了廣泛應用。相較于林、漁、牧業，MAS在作物領域的應用更加廣泛，研究者們引入了大量的資源用于發展分子標記圖譜以及尋找分子標記與表現型之間關聯性的研究。

在眾多的MAS技術中，RFLP是最早也是應用最為廣泛的一種分子標記。目前，其廣泛用于植物連鎖圖的構建、重要農藝性狀基因的分子標記等。其原理是基于植物基因組DNA上的堿基經替換、插入、缺失或重復等，造成某種限制性內切酶切位點的增加或喪失，從而產生限制性片段長度的多態性。對每一個DNA/酶組合而言，所產生的片段是特異性的，它可作為某一DNA所特有的“指紋”。其具有共顯性的特點，適于構建植物遺傳圖譜。其不足之處在于分析過程比較繁瑣和花費昂貴，不能用于大批量雜交種的純度鑒定；且RFLP必須經過Southern雜交，費時費力，對DNA多態檢出的靈敏度不高。

為了更深入的了解RFLP技術及其發展方向，本文對德溫特世界專利索引數據庫（DWPI）中涉及利用該技術進行植物育種的相關專利進行了分析和研究。檢索截止日期為2015年12月 31日，樣本數量為800篇專利文獻。

RFLP技術的發展

從圖1中可以看出，RFLP作為第一代分子標記技術在很長一段時期內（1989-2002年）占有絕對的統治地位，1999年到達頂峰后申請量開始大幅下滑，在2007年小幅上漲后繼續呈下降態勢，直到近兩年申請量已經以個位數計，這種現象的產生與RFLP技術本身的特點是分不開的。RFLP作為Botstein等于1980年提出的分子生物學最早的遺傳標記技術，標記的數目多且穩定，可用于構建高密度的遺傳圖譜。但是，由于其分析過程比較繁瑣和花費昂貴，費時費力，對DNA多態檢出的靈敏度不高等原因，逐漸被研究人員所摒棄，其主導地位被之后發展起來的第二、三代分子標記技術所取代。

主要申請國及進入國

某一國家專利技術申請量的多寡從一定程度上代表了該國技術的發展水平，而專利申請的進入國家則代表了申請人對于專利技術的布局戰略，這對于企業的國際化發展是非常重要的。因此，下面對RFLP專利技術的主要提出國和申請目標國進行分析和統計。

從圖2和圖3的申請量統計可見，在RFLP育種技術領域中，專利申請量最大的是美國，其次是日本、中國等，而這些主要的申請提出國在除本國之外其他各國的專利布局各有側重。如圖3所示，橫坐標代表提出申請的國家，不同顏色的柱形代表其進入的申請目標國家。美國除了在本國提出專利保護申請之外，在其他上百個國家也提出了申請，包括澳大利亞、加拿大、中國、日本等國家，并且其中有相當比例的申請是通過PCT途徑和EPO途徑提出的。可見，美國對其RFLP育種技術在很多國家進行了專利布局（很多申請量較小的國家沒有在圖上標出），這也體現了美國對全球生物資源的一種“圈地運動”。

日本對RFLP育種技術提出的申請也進入了幾十個國家，但主要是全球一些主要的農業國家，在其他比較小的國家布局較少，應該說側重點更強一些。與美國布局特點一致的是，日本的布局重點是美國、歐洲地區、中國和澳大利亞等國。

與上述技術發達國家形成鮮明對比的是，中國僅在少數國家進行了布局，申請數量也較少，這種形勢對于我國種子企業的國際化顯然非常不利。當然其中存在客觀原因，例如向國外提交專利申請并獲得保護的費用不菲，對于我國大多數中小種子企業來說是很大的經濟負擔。但是，對于有能力在國外進行專利布局的大型企業來說，有必要借鑒國外大企業的布局模式，將自己的專利技術有目的地布局到全球主要農業國家或者目標市場國中，為向國際化跨國公司發展開拓道路。

主要申請人

從RFLP育種技術專利的主要申請人來看，杜邦（先鋒）、迪卡（1998年被孟山都收購）、斯泰這三家排名前三位的公司，這說明了RFLP標記輔助育種技術目前主要掌握在這三家公司手里（圖4）。

圖1　歷年RFLP技術專利申請量

圖2　RFLP技術專利各國申請量分布

圖3　RFLP技術專利在各國申請的國家分布

圖4　RFLP技術主要申請人分布

杜邦公司成立于1802年，是目前世界500強企業中成立時間最早、資格最老的常青樹。2011年，公司研發投入為20億美元，擁有9500多名科學家和技術人員以及全球超過150家研發機構。目前，杜邦公司在全世界擁有21000多項有效專利以及超過15000項專利應用。在超過200年的公司歷史中，憑借其雄厚的資本、先進的經營理念、貫徹始終的創新精神和不斷擴展新領域的勇氣，杜邦公司創造了屬于自己的不敗奇跡。農業領域是目前杜邦業務版圖中的重要一環，雖然涉足育種領域比較晚，但憑借強大的綜合實力，特別是在1999年全資并購當時美國育種行業的龍頭企業——先鋒國際良種公司以后，杜邦一躍成為全球最大的農業育種企業，并長期保持這一殊榮。

從圖5中可以看出，杜邦（先鋒）在該技術的研發上占有絕對的優勢，不僅是開始最早的公司，在近十年來其他公司幾乎沒有針對該技術的專利申請的情況下，杜邦（先鋒）仍然沒有放棄對RFLP技術的研發。在RFLP技術20多年的發展歷程中，杜邦（先鋒）公司的申請量呈雙峰式發展趨勢。而申請量呈如此有規律的波動是與植物育種的周期性密切相關的。

迪卡公司曾經是美國第二大玉米企業，1998年被孟山都公司收購后，在RFLP育種技術的研究上投入了相當大的精力。但是，自2005年至今該公司并沒有提出相關的申請，似乎已放棄了對該技術的研發。

美國斯泰（STINE）公司是一家“非著名”的私人種業公司，長期致力于作物育種。該公司對于RFLP育種技術的研發集中在2001-2003年，之后便沒有針對該技術的申請。

RFLP技術在育種方面的應用

作為第一代分子標記技術，RFLP標記輔助作物育種所涉及的作物種類比較豐富，各作物的申請量也比較平均（圖6），但涉及糧食作物：玉米、豆類作物的申請量依然較多，均為上百項；主要糧食作物：麥類、高粱和水稻的申請量也較多；經濟作物：棉花；以及蔬菜作物：蕓苔屬植物的申請量也不在少數，均在30-50項之間。此外，煙草、番茄/茄子、向日葵、甜/辣椒、黃瓜、豌豆和薯類的申請量也在10項以上。可見，在RFLP發展的二十幾年里已經被廣泛應用于多種作物的育種技術中。

在RFLP技術發展的前十年，對于該技術的研究主要集中在玉米、豆類和蕓薹屬這3類作物中。從1999年起，分子標記技術得到了突破性發展，對于多種作物的RFLP育種研究技術也突飛猛進，其中玉米和豆類是研究的重點。在第二個十年中，麥類、水稻、高粱、蕓薹屬、煙草等作物的RFLP育種研究均得到了較大的發展，申請量激增。而在2004年之后，各類作物的申請量均有下降，近幾年來已減少至每年10項以下，但是玉米和豆類的申請量始終比其他作物品種多。

圖5　歷年RFLP技術主要申請人申請量分布

圖6　RFLP技術申請量各領域分布

圖7　RFLP技術申請量（按性狀分布）

圖8　歷年RFLP技術申請量（按性狀分布）

圖9　主要申請國申請量（按領域分布）

圖10　主要申請國申請量（按性狀分布）

圖11　主要申請人申請量比例（按企業分）

作物多基因性狀方面，如抗病和抗逆相關研究在多基因控制性狀的發展最快。從圖7和圖8中可以看出，對作物抗性和單位面積產量的改良是研發熱點，在1999-2012年間，育種研發人員的關注焦點一直是對作物抗性和產量方面的改良，特別是對產量性狀RFLP標記的開發早在1989年就已經開始，并在2000年和2001年達到頂峰；此外，作物育性的改良、作物品質的提升也是重要的育種目標，與之相關的申請量僅次于抗性和產量改良。而關于抽穗期、株高、分蘗性狀相關的RFLP專利申請量則遠遠沒有抗性和產量的多，對這三個性狀RFLP標記的研發也是間斷性地進行，2001年是這三個性狀RFLP標記研發的高峰期。而隨著分子標記技術的更新換代，對于作物RFLP標記的研發勢頭在近幾年已大幅下降。

如圖9、10所示，在申請量排名前4位的主要申請機構中，美國的申請量最大，較側重于玉米和豆類的研究，對于性狀的研究主要集中在抗性、產量、品質和育性中；日本雖排名第二，但數量上遠不及美國，對于RFLP技術的研究主要集中在水稻，并致力于抗性的提高；歐洲各國的申請量與日本相近，主要研究目標既包括玉米、水稻、麥類等糧食作物，也包括番茄等蔬菜作物，對于性狀的改良也集中在抗性和育性的提高；而小麥作為中國重要的糧食作物，自然是研究的首要目標，并且，我國的申請更注重抗性和品質的提高。

在申請量排名前4位的主要申請人中，玉米的申請人主要為杜邦（先鋒）和迪卡兩家公司，而豆類的申請人則主要為美國斯泰公司，先正達公司則較側重于玉米中RFLP的研究（圖11）。

通過以上對RFLP育種技術相關的專利申請的初步分析，本文梳理了該技術的發展脈絡以及研究現狀，對于該技術未來的發展前景和展望，還有待于進一步的深入研究和分析。

參考資料

1.董秀文，等.RFLP分析在作物育種上的應用［J］.黑龍江農業科學，1994，（4）.

2.沈革志.RFLP在作物育種上的應用［J］.上海農業學報，1992，8，（2）.

3.鄭康樂.分子標記在作物遺傳育種中的應用［M］.南京：江蘇省科學出版社，1991.

4.石運慶，牟秋煥，李鵬，等.DNA分子標記及其在作物遺傳育種中的應用［J］.山東科學，2005，18（2）：22-28.

5.Halward T M，et al. RFLP map of peanut［A］.Phillips R L &Vasil I K. DNA -based markers in plants［C］，Nethelands：Kluwer Academic Publishers，1994，246-260.

（作者單位：國家知識產權局專利局專利審查協作天津中心審查業務部；國家知識產權局專利局專利審查協作北京中心醫藥生物發明審查部，專利審查員）