腎腦復元湯聯合人臍帶間充質干細胞移植對MCAO大鼠神經功能恢復及VEGF表達的影響*

胡國恒　侯小花　李映辰　王小菊　鄒婷（.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南　長沙　40007；湖南中醫藥大學，湖南　長沙　4008）

?

腎腦復元湯聯合人臍帶間充質干細胞移植對MCAO大鼠神經功能恢復及VEGF表達的影響*

胡國恒1侯小花2△李映辰2王小菊2鄒婷2
（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；2湖南中醫藥大學，湖南長沙410208）

【摘要】目的探討腎腦復元湯聯合人臍帶間充質干細胞（HUC-MSCs）移植對腦缺血損傷的神經保護機制。方法制作雄性SPF級Sprague Dawley大鼠大腦中動脈閉塞（MCAO）模型108只，隨機分為3組，即模型組36只、干細胞組36只、聯合組36只，各組再根據處死時間分為3 d、7 d、14 d 3個亞組；觀察各組大鼠神經功能缺損評分，以及用免疫組織化學染色以及Western blot法檢測腦缺血邊緣區血管內皮生長因子（VEGF）的表達。結果1）干細胞組和聯合組在第3天、7天、14天的神經功能缺損評分均低于同時段模型組（均P＜0.01）；聯合組在第7、14天神經功能缺損均低于同時段干細胞組（P＜0.05或P＜0.01），聯合組和干細胞組在第3天的神經功能缺損無明顯差異（P＞0.05）；2）免疫組化法檢測及Western blot法檢測腦缺血邊緣區VEGF的表達均提示:第3、7、14天干細胞組、聯合組VEGF陽性表達均高于模型組（P＜0.01），聯合組在第7、14天VEGF陽性表達高于干細胞組（P＜0.05），聯合組和干細胞組在第3天VEGF的表達無差異（P＞0.05）。結論腎腦復元湯聯合人臍帶間充質干細胞移植能顯著改善MCAO大鼠神經功能損傷，促進腦功能的恢復。其發揮對腦的保護作用的機制可能是通過提高內源性VEGF的表達。

【關鍵詞】腎腦復元湯人臍帶間充質干細胞腦缺血再灌注損傷血管內皮生長因子

缺血性卒中是腦血管疾病（CVD）中導致人類死亡和致殘的主要原因之一，在中國的CVD中缺血性腦血管病占70%左右［1］。缺血性腦血管病是由腦主要動脈的血流短暫或持久減少而引起的一組腦組織受損的疾病。近年來，隨著對人臍帶間充質干細胞（HUC-MSCs）的深入研究，以及近年來國內臍帶干細胞庫的建立，使眾多學者逐漸認識到其在組織修復中的價值及應用前景。大量研究［2-3］也證實HUC-MSCs移植的安全性。前期研究表明［4-5］HUC-MSCs和腎腦復元湯對神經功能恢復、血管內皮生長因子（VEGF）表達有促進作用。因此本實驗研究腎腦復元湯聯合人臍帶間充質干細胞對MCAO大鼠神經功能恢復及VEGF表達的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物雄性SPF級Sprague Dawley大鼠，4月齡，體質量（280±10）g，購自斯萊克景達實驗動物公司，生產許可證號: SYXK（湘）2011-0003；動物合格證號:43004700001488；動物飼養于湖南中醫藥大學SPF級實驗動物中心，許可證號:SYXK（湘）2009-0001。

1.2試藥與儀器GAPDH抗體［Cell Signaling（CST），貨號:5174］；VEGF（博士德生物公司，貨號:BA0269）。腎腦復元湯，組成:熟地黃10 g，山茱萸10 g，山藥15 g，黃芪30 g，紅景天20 g，牡丹皮10 g，當歸尾10 g，赤芍10 g，地龍10 g，丹參10 g，川芎10 g。藥材均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，并經藥劑科劉紅宇副主任藥師鑒定為道地藥材。采用自動中藥煎藥壺煎藥:每劑一煎加水500 mL，煎汁約200 mL；二煎加水300 mL，煎汁約150 mL。二煎混合，于水浴鍋內蒸發濃縮至含生藥2 g/mL，4℃冷藏備用。

1.3模型制備大鼠術前24 h禁食不禁水，術前稱體質量，10%水合氯醛溶液（350 mg/kg），腹腔注射麻醉并保溫。用改良Zea Longa's線栓法阻斷左側大腦中動脈制作大腦中動脈閉塞（MCAO）局灶性腦缺血模型［6］。缺血時間達到120 min后，拔除線栓即形成再灌注。再灌注2 h后采用Zea Longa 5分制神經功能評分表初步評價造模情況［7］，分值在1～3分者入組。剔除標準:身體狀態極差（精神狀態極差，癲癇，嚴重呃逆、腹瀉等）；未到時間點死亡。因大鼠死亡致樣本量不足時隨機替補。

1.4分組與給藥選取造模成功的大鼠，將模型大鼠隨機分成模型組36只，干細胞組36只，聯合組36只，各組再根據處死時間分為3、7、14 d 3個亞組，每組12只，其中免疫組化法6只，Western blot法檢測6只。各組于造模后24 h開始給藥，聯合組和干細胞組大鼠局灶性腦缺血2 h再灌注1 d后，經尾靜脈注入人臍帶間充質干細胞，每只大鼠接受10 μL（5×104/μL），模型組經尾靜脈注入生理鹽水。模型組及干細胞組分別灌胃生理鹽水（10 mL/kg），聯合組灌胃等量腎腦復元湯。灌胃每日1次，直至處死。

1.5標本采集與檢測

1.5.1mNSS評分各組大鼠在造模前24 h、造模成功后24 h、處死前采用改良大鼠神經功能缺損嚴重程度評分量表（m-NSS）［8］分別進行評分。標準mNSS量表包括4大項，總分18分，完全正常=0分，完全功能缺失=18分。每只動物觀察兩次計算平均數。

1.5.2腦組織VEGF檢測MCAO模型鼠分別于移植后3、7、14 d取大鼠處死。予10%水合氯醛（0.35 mL/ 100 g）腹腔注射對大鼠麻醉后，剪開腹腔及胸腔，暴露心臟及腹主動脈，夾閉腹主動脈，9號注射針頭從心尖部刺入左心室，剪開右心耳；先用100 mL生理鹽水灌注至右心耳沖出清透液體后，換成4%多聚甲醛灌注約300 mL，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛內固定24 h，常規石蠟切片，行免疫組織化學染色檢測VEGF以及Western Blot法檢測VEGF。HE染色后每組檢測8張切片，分別選取缺血海馬區5個互不重疊的視野，在光鏡（×100）下觀察各組梗死區神經細胞的情況。免疫組織化學染色檢測VEGF時，每組檢測8張切片，分別選取缺血海馬區5個互不重疊的視野，采用IPP6.0軟件進行圖像分析，測定陽性細胞的平均光密度值。平均光密度值高，則細胞陽性染色強度高。Western Blot法檢測VEGF時，采用IPP6.0軟件對條帶進行圖像分析，VEGF蛋白表達的指標以VEGF產物與GAPDH產物條帶灰度值的比值（即相對灰度值）來表示，相對灰度值高，則說明VEGF蛋白表達越高。

1.5.3HUC-MSCs的分離、培養、鑒定和標記超凈工作臺上剝去臍帶動靜脈，PBS洗去殘留血液，用無菌眼科剪反復剪切成1 mm小塊為止；參照秦力維等［9-10］的方法用組織塊法培養HUC-MSCs。采用流式細胞儀分別對細胞表面標記物進行檢測，按照國際細胞療法協會關于間充質干細胞的鑒定標準，要求CD73、CD105、CD90、CD29陽性表達率超過95%，CD45、CD34、CD14、CD79a/CD19和HLA-DR的表達率低于2%；臺盼藍染色檢測細胞活率超過85%。此外，參照Li等［11-12］的方法，將培養細胞鑒定具備分化成脂、成骨的能力。

1.6統計學處理采用SPSS19.0統計軟件處理。實驗數據經正態分布檢驗后以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組不同時間點mNSS比較見表1。缺血再灌注后1 d，3組大鼠的mNSS差異均無統計學意義（P＞0.05），隨后各組分值逐漸降低，在缺血再灌注后3 d，聯合組和干細胞組mNSS差異均無統計學意義（P＞0.05），但兩組的評分均低于模型組（P＜0.05）。隨后在7、14 d，聯合組大鼠的mNSS評分均明顯低于其他兩組（P＜0.05或P＜0.01）。說明腎腦復元湯聯合人臍帶間充質干細胞能明顯改善腦缺血再灌注后神經功能恢復。

表1　各組不同時間點mNSS比較（分，

表1　各組不同時間點mNSS比較（分，

與模型組同時期比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與干細胞組同時期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別　n　術后3 d術后7 d術后14 d模型組　6　9.0±0.9　7.7±0.8　5.8±0.8術前1 d術后1 d 0　9.5±1.0干細胞組　6　7.8±1.0*5.8±0.4**4.2±0.8**0　9.5±1.4聯合組　6　0　9.3±1.4 7.5±1.0**4.8±0.8**△3.0±0.6**△△

2.2各組梗死區神經細胞HE染色見圖1。術后第14日，大鼠斷頭取腦，固定后行HE染色，各組均可見梗死區，神經細胞明顯減少，可見大量神經細胞變性、壞死，核固縮、碎裂、溶解。聯合組及干細胞組病理變化均較模型組輕，神經細胞變性、壞死數量明顯變少。聯合組與干細胞組比較，聯合組病理變化較干細胞組輕，神經細胞變性及壞死數量明顯減少。3組均未發現腫瘤細胞及異形細胞。模型組中可見大量神經細胞變性、壞死，干細胞組可見中等量神經細胞變性、壞死，聯合組僅見少量神經細胞變性、壞死。

圖1　各組缺血海馬區（HE染色，100倍）

2.3免疫組化法及Western Blot法檢測VEGF表達見表2，圖2，圖3。隨著時間的延長，各組VEGF平均光密度逐漸升高，模型組在術后7 d平均光密度增長達高峰，隨后逐漸下降。干細胞組和聯合組隨著時間的延長，VEGF平均光密度逐漸升高，術后3 d，兩組VEGF平均光密度無明顯差異（P＞0.05），但與模型組比較均有明顯升高（均P＜0.01）；7 d和14 d組，聯合組均較其他兩組VEGF平均光密度明顯升高（均P＜0.01）；7 d和14 d組，干細胞組VEGF平均光密度較模型組明顯升高（均P＜0.01）。說明腎腦復元湯聯合人臍帶間充質干細胞可以促進VEGF的表達。Western Blot法檢測VEGF檢測顯示其灰度值結果同上。術后3 d，聯合組和干細胞組VEGF相對灰度值無明顯差異（P＞0.05），但與模型組比較均有明顯升高（均P＜0.01）；7 d和14 d組，聯合組均較其他兩組VEGF相對灰度值明顯升高（均P＜0.01）；7 d和14 d組，干細胞組VEGF相對灰度值較模型組明顯升高（均P＜0.01）。說明腎腦復元湯聯合人臍帶間充質干細胞可以促進VEGF的表達。

表2　各組不同時間點VEGF表達比較

表2　各組不同時間點VEGF表達比較

組別　時間　免疫組化法　Western-Blot法模型組　術后3 d　0.25±0.01　0.34±0.01 （n＝6）　術后7 d　0.27±0.01　0.36±0.01術后14 d　0.24±0.01　0.33±0.01干細胞組　術后3 d　0.28±0.01**　0.38±0.01**（n＝6）　術后7 d　0.30±0.01**　0.50±0.01**術后14 d　0.30±0.01**　0.50±0.01**聯合組　術后3 d　0.29±0.01**　0.39±0.01**（n＝6）　術后7 d　0.32±0.01**△△　0.53±0.01**△△術后14 d　0.33±0.01**△△　0.70±0.01**△△

圖2　各組VEGF陽性細胞表達（400倍）

圖3　各組Western-Blot法檢測VEGF表達

3　討論

局灶性缺血時，VEGF可在不同組織細胞中表達，進而促進血管發生，以保證缺血組織在恢復過程中微循環的建立。VEGF不僅是一種強效的有絲分裂原，可直接作用于內皮細胞，誘導血管再生，并增加血管通透性，同時還是一種誘導血管形成和影響血管通透性的因子［13］。VEGF在人和動物胚胎發育階段呈高水平表達，介導生理過程的血管生成。正常成年組織中表達量很少，但在肺、腎、腦等組織中仍有一定低水平的表達。而在某些病理條件下，如缺血、缺氧時，VEGF表達明顯增加，尤其以腦組織中的VEGF表達升高明顯。卒中發生后，缺血半暗帶區會產生大量VEGF等與血管新生有關的生長因子，促進血管新生［14］。有研究認為，VEGF對CNS的作用遠不局限于調節血管的形成與生長，在腦缺血發生時，VEGF對神經系統具有多重保護作用，涉及血管形成、促進神經發生、直接的神經營養和神經保護作用及抗凋亡等多種機制［15］。

本實驗研究顯示，腦缺血再灌注損傷后大鼠自身VEGF有一定表達，人臍帶間充質干細胞移植能夠升高VEGF的表達水平，而腎腦復元湯聯合人臍帶間充質干細胞移植治療能夠顯著提高VEGF的表達水平。與模型組比較，腎腦復元湯聯合人臍帶間充質干細胞能促進腦缺血再灌注大鼠神經功能損傷的恢復，因此證明腎腦復元湯聯合人臍帶間充質干細胞移植治療能夠發揮對腦的保護作用，其發揮作用的可能途徑是通過提高內源性VEGF的表達，從而促進缺血區新生血管的生成。與單純干細胞移植治療組比較，聯合組對MCAO大鼠神經功能恢復的效果更顯著，因此證明腎腦復元湯和外源性MSCs移植治療腦缺血再灌注損傷具有整體協同作用。兩者聯合作用促進內源性VEGF表達的具體機制有待進一步研究。

術后3 d，各組VEGF平均光密度開始逐漸升高。說明在腦缺血損傷的早期機體即開始發揮對損傷腦組織的修復作用。在第3天時，聯合組和干細胞組模型組VEGF的表達明顯高于模型組，說明聯合組和干細胞組在腦缺血損傷早期即可更大力度發揮對損傷腦組織的修復作用。模型組在術后7 d平均光密度增長達高峰，隨后該組VEGF平均光密度逐漸下降，干細胞組第7日，14 d VEGF的表達逐漸處于平臺期，但聯合組在第7日至第14日VEGF的表達仍呈現增長趨勢，說明聯合組能更大程度促進VEGF的表達，進一步發揮對損傷腦組織的修復作用，促進血管新生。其原因可能是腎腦復元湯能夠延長HUC-MSCs在體內存活的時限，從而使內源性VEGF的表達持續升高。

本實驗HE染色提示聯合組大鼠腦組織的神經細胞變性相對較輕，其可能原因是聯合組促進了內源性VEGF的表達，從而促進神經細胞的新生。另外本實驗中未出現因腎腦復元湯聯合HUC-MSCs移植治療引起的明顯不良反應，組織學行HE染色觀察各組未見到明顯腫瘤細胞及異形細胞。因此本實驗也從側面驗證了腎腦復元湯聯合HUC-MSCs移植治療腦缺血再灌注損傷近期沒有明顯的致瘤性，當然中藥聯合干細胞移植治療的遠期療效及致瘤性尚需進一步研究。

參考文獻

［1］王擁軍，張蘇明.中國缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發作二級預防指南2010［J］.中華神經科雜志，2010，43（2）: 154-160.

［2］何君，李洋，陳威，等.人臍帶間充質干細胞靜脈輸注小鼠的安全性［J］.中國比較醫學雜志，2013，23（9）:36-41.

［3］張培培，劉慧純，閻曉玲，等.腦缺血再灌注損傷大鼠尾靜脈移植臍帶間充質干細胞的安全性［J］.中國組織工程研究，2012，16（19）:2581-2584.

［4］Liao WB，Zhong J，Yu JX.Therapeutic benefit of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells in intracerebral hemorrhage rat: implications of anti-inflammation and angiogenesis［J］.Cell Physiol Biochem，2009，24:307-316.

［5］胡國恒，李映辰，鄒婷，等.腎腦復元湯對MCAO大鼠炎癥因子及神經營養因子表達的影響［J］.中藥藥理與臨床，2015，31（2）:81-85.

［6］Park KI，Ourednik J，Ourednik V.Global gene and cell replacement strategies via stem cells［J］.Gene Ther，2002，9 （10）:613-624.

［7］Reyes M，Lund T，Lenvik T.Purification and exvivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells［J］.Blood，2001，98（9）:2615-2625.

［8］Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem clls［J］.Science，1999，284 （5411）:143-147.

［9］秦力維，張寧坤，郭建巍，等.人臍帶間充質干細胞的高效分離及對小鼠免疫功能的影響［J］.轉化醫學雜志，2014，3 （6）:333-336.

［10］李鐸，石釧，洪敬欣，等.組織塊法分離人臍帶間充質干細胞的研究［J］.中國醫藥導報，2011，8（24）:19-22.

［11］Li DH，Wang CH，Shan W.Human amnion tissue injected with human umbilical cord mesenchymal stem cells repairs damaged sciatic nerves in rats［J］.Neural Regen Res，2012，7 （23）:1771-1778.

［12］何紹清，羅振宇，劉秋英，等.人臍帶間充質干細胞分離培養及向脂肪與成骨細胞的分化［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2010，14（14）:2492-2496.

［13］周江，郭靖濤，王福華，等.血管內皮生長因子與急性心肌梗死介入治療術后再狹窄研究進展［J］.河北醫學，2014，20（12）:2138-2141.

［14］Liman TG，Endres M.New vessels after stroke: postischemic neovascularization and regeneration［J］.Cerebrovasc Dis，2012，33:492-499.

［15］栗世方，王任直，李桂林.血管內皮生長因子治療腦缺血實驗研究進展［J］.中國醫學科學院學報，2005，27（1）:115-119.

·研究報告·

Effect of Shennao Fuyuan Tang Combined with Transplantation of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells on the Recovery of Neural Functional and Expression of VEGF in Cerebral Ischemic Rats

HU Guoheng，HOU Xiaohua，LI Yingchen，et al.The First Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410007，China.

【Abstract】Objective: To study the nerve protecting function of Shennao Fuyuan Tang combined with transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells（HUC-MSCs）on the cerebral ischemic rats.Methods: MCAO models of rats were made and randomly divided into the model group（n=36），HUC-MSCs transplantation group（HUC-MSCs group）（n = 36）and Shennao Fuyuan Tang combined with HUC-MSCs transplantation group （the combined group）（n=36），and these groups were separately divided in to another 3 groups by execution time （3rd，7th，14thday）.The Neurological Severity Scores（NSS）were observed，and the expression of VEGF was detected with immunohistochemical staining and Western blot methods.Results: 1）NSS on 3rd，7thand 14thday of both HUC- MSCs group and the combined group were lower than those of the model group at the same time section （P＜0.01）.NSS of the combined group on 7thand 14thday were lower than those of the HUC-MSCs group at the same time section（P＜0.05 or P＜0.01）.There was no significant difference in NSS between the combined group and the HUC-MSCs group in 3rd day（P＞0.05）.2）The expression of VEGF in edge area of cerebral ischemia with immunohistochemical staining and Western blot methods to detect showed that the expression of VEGF of both the HUC-MSCs group and the combined group on on 3rd，7thand 14thday was higher than that of the model group（P＜0.01）.The expression of VEGF of the combined group on 7thand 14thday was higher than that of the HUC-MSCs group at the same time section（P＜0.05）.There was no significant difference in the expression of VEGF between the combined group and the HUC-MSCs group in 3rd day（P＞0.05）.Conclusion: Shennao Fuyuan Tang combined HUC MSCs transplantation can significantly improve the nerve function damage of MCAOrats，and promote the recovery of brain function.It plays the role of the protection of brain mechanism probably by enhancing endogenous VEGF expression.

【Key Words】Shennao Fuyuan Tang；Human umbilical cord mesenchymal stem cells（HUC-MSCs）；Ischemia stroke；VEGF

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:A

文章編號:1004-745X（2016）01-0004-04

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.02

*基金項目：國家自然科學基金項目（81273751）

通信作者△（電子郵箱：504771117@qq.com）

收稿日期（2015-10-07）