電頸針干預(yù)對急性腦出血大鼠腦組織水通道蛋白4表達(dá)及腦含水量的影響*

王茜　唐美霞　鄭淑美　杜若桑　崔海（首都醫(yī)科大學(xué)，北京　100069）

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電頸針干預(yù)對急性腦出血大鼠腦組織水通道蛋白4表達(dá)及腦含水量的影響*

王茜唐美霞鄭淑美杜若桑崔海△
（首都醫(yī)科大學(xué)，北京100069）

【摘要】目的研究電頸針干預(yù)對急性腦出血大鼠腦組織水通道蛋白4（AQP4）表達(dá)、腦含水量等的影響，探討電頸針對急性期腦出血后腦水腫的治療作用。方法研究將84只成年SD大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型組，電頸針組；模型組和電頸針組依據(jù)干預(yù)時間分別設(shè)1、3、5 d 3個亞組，對相應(yīng)組進(jìn)行腦組織含水量、AQP4含量和mRNA含量檢測。結(jié)果模型組與電頸針各組AQP4蛋白含量均高于假手術(shù)組，且電頸針組較模型組減低。電頸針3 d組AQP4 mRNA表達(dá)低于模型3 d組，且均高于假手術(shù)組。模型與電頸針各組大鼠腦組織含水量均高于假手術(shù)組（P＜0.01），電頸針組各亞組腦組織含水量均低于模型組（P＜0.05）。結(jié)論電頸針能顯著降低腦出血大鼠AQP4蛋白和基因表達(dá)、腦組織含水量，可以抑制腦出血后腦水腫，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】電頸針腦出血AQP4腦含水量

腦出血是指非外傷性腦實質(zhì)出血，其發(fā)病率、死亡率、致殘率均較高［1］。隨著社會老齡化發(fā)展，腦出血的發(fā)病率逐年增加，嚴(yán)重危害老年人生活質(zhì)量。腦出血后腦水腫導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，形成腦疝，是腦出血致死的常見原因。近年來，一些研究表明，腦出血后腦水腫的形成與腦組織中水通道蛋白4（AQP4）的參與密切相關(guān)。本研究以AQP4為切入點，通過對檢測腦出血大鼠腦組織AQP4含量、腦含水量的變化，研究電頸針對大鼠腦出血后腦水腫的治療作用。

1　材料與方法

1.1動物與分組清潔級SD大鼠84只，雄性，體質(zhì)量（250±20）g，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。分籠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)動物房內(nèi)，溫度（23±2）℃，12/12 h光照周期模擬晝夜交替，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。隨機分為假手術(shù)組12例、模型組36例與電頸針組36例。模型組和電頸針組分別分為1、3、5 d 3個亞組，每組12只大鼠。每組中6只用于腦組織含水量檢測，6只用于AQP4蛋白含量和AQP4 mRNA檢測。

1.2模型制備采用膠原酶誘導(dǎo)的大鼠腦出血模型［2-3］。1）麻醉:用10%水合氯醛，按0.4 mL/100 g劑量，對大鼠進(jìn)行腹腔注射。2）固定:將麻醉后的大鼠顱骨備皮。將大鼠俯臥固定在腦立體定位儀上，固定門齒于門齒鉤上，將左右水平針分別穿入耳道并固定。3）定位:將備皮后的大鼠頭部皮膚常規(guī)消毒，沿耳間線于兩耳中間位置切開1 cm左右，暴露冠狀縫、矢狀縫和前囟。參照大鼠腦定位圖譜，找到前囟，于前囟后0.2 mm，右側(cè)旁開3 mm處。用鉆頭在顱骨表面垂直于顱骨鉆一直徑為1 mm的圓孔，達(dá)硬腦膜表面。4）注射:用1 μL的微量注射器垂直緩慢進(jìn)針，進(jìn)針深度5 mm。注射配制好的膠原酶溶液0.5 μL（含1U膠原酶Ⅶ），緩慢注射，5 min注射完畢，留針5 min。5）縫合:緩慢出針后，縫合皮膚。放入籠中。術(shù)后2 h根據(jù)Longa法［4］進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分:0分，未見任何神經(jīng)缺失癥狀；1分，不能完全伸展進(jìn)針對側(cè)前爪或后爪（左側(cè)）；2分，行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，有追尾現(xiàn)象；3分，行走時向進(jìn)針對側(cè)傾倒，不能站立；4分，不能自發(fā)行走，意識障礙。評分1分以上則可認(rèn)為模型制備成功，納入實驗，余者剔除。不足預(yù)定數(shù)組按照隨機抽樣原則補齊動物并重新造模。

1.3干預(yù)方法每組于造模后1 d給予電針干預(yù)，1、3、5 d亞組分別干預(yù)1、3、5次，每日1次。取穴:參照華興邦等制定的《實驗動物穴位圖譜》，取雙側(cè)風(fēng)池，供血。常規(guī)消毒，以0.25～0.30 mm毫針兩根，分別刺入雙側(cè)風(fēng)池和供血，將G-6805-2型電麻儀正極接雙側(cè)風(fēng)池穴毫針，負(fù)極接供血穴毫針。疏波，頻率2次/s，強度0.3 mA，留針30 min，每日1次。

1.4標(biāo)本采集與檢測假手術(shù)組于術(shù)后1 d后，模型組、電頸針組分別于術(shù)后1，3，5 d將大鼠麻醉后斷頭處死，在冰板上迅速開顱取腦。隨機選取6只，以注射點為中心冠狀切開，取冠狀腦片3 mm左右，吸除表面水分及血漬，用于腦組織含水量檢測。另6只取血腫及其周圍腦組織100 mg左右，用于AQP4蛋白含量和mRNA檢測。

1.5腦組織AQP4含量測定

1.5.1Western blot檢測腦組織AQP4蛋白含量用RIPA蛋白抽屜試劑溶解腦組織，按BCA蛋白定量試劑盒使用說明操作，測定蛋白濃度。用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時間1 h。轉(zhuǎn)膜完成后麗春紅染色試劑對膜進(jìn)行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。膜完全浸沒于5%BSA-TBST中，水平搖床孵育1 h。5%BSA-TBST稀釋一抗，4℃水平搖床孵育過夜。次日，TBST洗膜3次之后加入二抗，室溫孵育40 min。再用TBST洗膜3次，每次10 min。最后用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光顯影。圖片掃描后，對圖像進(jìn)行灰度分析。

1.5.2Real-time PCR檢測腦組織AQP4 mRNA的表達(dá)檢索AQP4核苷酸序列，并設(shè)計引物，引物合成（見表1）。用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA。取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用SYBR PCR Mixture進(jìn)行擴增，擴增程序為:95℃10 min，（95℃15 s，58℃60 s）×45個循環(huán)。采用2-△△ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對定量分析。

表1　目的基因引物序列

1.6腦組織含水量的測定于相應(yīng)時間將各組用于腦含水量檢測的腦組織分別用電子天平稱質(zhì)量，為濕質(zhì)量。置于60℃烘箱烘干48 h以上，以反復(fù)稱質(zhì)量至不再減少，為干質(zhì)量。腦含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%，計算腦組織含水量。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料以（）表示，用單因素方差分析進(jìn)行組間差異比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組腦組織AQP4表達(dá)

2.1.1Western blot檢測各組腦組織AQP4蛋白含量見圖1。與假手術(shù)組相比，模型3 d組和電頸針3 d組AQP4蛋白含量明顯增高，且電頸針組于模型組相比，AQP4含量有所降低。

圖1　各組AQP4蛋白含量比較

2.1.2Real-time PCR檢測各組腦組織AQP4 mRNA的表達(dá)見表2。模型和電頸針各組血腫部位及周圍組織AQP4 mRNA表達(dá)明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），模型組AQP4 mRNA表達(dá)1 d明顯增強，3 d時達(dá)到高峰，5 d時有所下降但仍較高。與模型組相比，電頸針組1、3、5 d AQP4 mRNA表達(dá)均有明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2各組大鼠不同時間點腦組織含水量見表3。腦出血后1 d大鼠腦含水量顯著增高，3 d時達(dá)到高峰，之后下降。與假手術(shù)組相比，模型組和電頸針組均有顯著差異（P＜0.01）。同時段電頸針組腦組織含水量低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各組大鼠腦組織AQP4 mRNA比較

表2　各組大鼠腦組織AQP4 mRNA比較

與模型組同時間比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別n　5 d電頸針組　6　1.55±0.02**假手術(shù)組6　-模型組　6　1.60±0.02 1 d　3 d 1.56±0.02*　1.63±0.01**1.28±0.04　-1.60±0.03　1.67±0.02

表3　各組大鼠腦組織含水量比較（%，

表3　各組大鼠腦組織含水量比較（%，

組別n　5 d電頸針組　6　75.50±1.28*假手術(shù)組6　-模型組　6　77.03±0.52 1 d　3 d 77.25±0.50*　78.59±0.88**72.97±0.63　-78.78±1.43　80.06±0.59

3　討論

AQP4是腦組織中表達(dá)最高的水孔蛋白，在血腦屏障及腦-腦脊液屏障的星形膠質(zhì)細(xì)胞終足及室管膜細(xì)胞上高度表達(dá)，直接參與了水分子的雙向轉(zhuǎn)運，對調(diào)節(jié)腦組織的水液代謝起著十分重要的作用［5］。有報道顯示［6-9］，AQP4表達(dá)增高與腦出血后血腦屏障破壞密切相關(guān)，可認(rèn)為腦出血后腦水腫程度與AQP4的表達(dá)成正相關(guān)。本實驗中，模型組和電頸針組各亞組AQP4含量均顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。AQP4含量的變化趨勢與腦組織含水量的變化趨勢相一致，提示AQP4參與了腦出血后腦水腫，其含量與腦出血后腦水腫程度密切相關(guān)。

電頸針是傳統(tǒng)針刺療法與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)解剖相結(jié)合的治療方法，目前在臨床上應(yīng)用廣泛。本實驗選取了頸項部的風(fēng)池、供血二穴。頸項部是人體六條陽經(jīng)聯(lián)系頭部的必經(jīng)之路，故針刺風(fēng)池、供血二穴既可開竅醒神，又可疏通五臟六腑之精氣，使之上榮腦絡(luò)。電針選用疏波，刺激風(fēng)池、供血可以改善椎-基底動脈的供血情況，還可以刺激局部神經(jīng)反射的恢復(fù)和重建。已有研究證明電頸針可以改善椎-基底動脈供血［10-11］，抑制凋亡，影響神經(jīng)傳導(dǎo)遞質(zhì)的釋放［12］，從而對腦血管病有積極的治療作用［13］。本實驗中，電頸針組與模型組各時間點相比，大鼠腦組織含水量、AQP4含量均減低，提示電頸針在腦出血急性期對腦出血后腦水腫有治療作用。

本研究表明電頸針干預(yù)在腦出血急性期通過調(diào)控AQP4，達(dá)到抑制腦出血后腦水腫，保護(hù)神經(jīng)元的作用。腦組織含水量、AQP4含量均在3 d時達(dá)到頂峰，提示在3 d內(nèi)進(jìn)行電針干預(yù)能有效抑制腦出血腦水腫的發(fā)展，為進(jìn)一步探討治療介入時間提供思路。AQP4在腦出血后細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫的發(fā)展過程中均有重要作用，但其作用通路的研究尚不確切。目前針對AQP4對腦出血后腦水腫的調(diào)控作用已較明朗，各干預(yù)方法對AQP4的作用效果也有研究，對于其上游通路的尋找，和對其通路的有效干預(yù)將是后續(xù)關(guān)于腦出血后腦水腫的探求思路。同時積極探索其他影響因素，以期為腦出血的臨床診療提供理論依據(jù)和治療思路。

參考文獻(xiàn)

［1］王隴德.中國腦卒中防控要有戰(zhàn)略與戰(zhàn)術(shù)［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2012，41（2）:1.

［2］Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M，et al.Collagenaseinduced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1990，21 （5）:801.

［3］Del BM，Yan HJ，Buist R，et al.Experimental intracerebral hemorrhage in rats.Magnetic resonance imaging and histopathological correlates［J］.Stroke，1996，27（12）:2312，2319.

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）:84.

［5］Saadoun S，Papadopoulos MC.Aquaporin -4 in brain and spinal cord oedema［J］.Neuroscience，2010，168（4）:1036.

［6］穆學(xué)芳.地塞米松對大鼠腦出血后水通道蛋白4表達(dá)的影響［D］.大連:大連醫(yī)科大學(xué)，2009.

［7］陳艷.安腦平?jīng)_湯對大鼠腦出血后腦水腫及AQP-4、MMP-2/9蛋白表達(dá)影響的研究［D］.長沙:湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

［8］許東，趙劍，李盟，等.大鼠腦出血后水腫與細(xì)胞內(nèi)AQP4表達(dá)的相關(guān)研究［J］.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2015，37（5）:389.

［9］牛蕾蕾，李紅玲，陳玉燕，等.不同介入時間高壓氧治療對實驗性腦出血大鼠出血灶周圍水腫及水通道蛋白-4表達(dá)的影響［J］.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2014，29（9）:810.

［10］王強，朱廣旗，胡蓉.針刺風(fēng)池、“供血”穴治療椎-基底動脈供血不足臨床療效及機制探討［J］.中國針灸，2009，29 （11）:861.

［11］朱冬梅.電針風(fēng)池穴、供血穴治療椎動脈型頸椎病的臨床觀察［J］.針灸臨床雜志，2009，25（7）:41.

［12］楊續(xù)艷，王銳，郭淑穎，等.電項針療法對大鼠腦缺血再灌注模型腦組織EPO表達(dá)的影響［J］.針灸臨床雜志，2009，25（5）:24.

［13］王桂芳，杏金勇，崔海.電項針治療腦出血恢復(fù)期31例臨床觀察［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，18（7）:62.

·研究報告·

Effects of Neck Electrical Acupuncture on Brain Water Content and Aquaporin4 Expression in Intracerebral Hemorrhage Rats

WANG Xi，TANG Meixia，ZHENG Shumei，et al.Capital Medical University，Beijing 100069，China.

【Abstract】Objective: To investigate the effects of neck electrical acupuncture on brain water content and AQP4 expression in intracerebral hemorrhage rats.Methods: 84 SD rats were randomly divided into three groups: the sham operated group，the model group and neck electrical acupuncture group.The model group and neck electrical acupuncture group were divided into three subgroups: one-day subgroup，three-day subgroup and five-day subgroup.The brain water content，the content of AQP4 and mRNA in the corresponding group were detected.Results: The content of AQP4 protein higher in model group and neck electrical acupuncture group than in the sham operated group，and the the content of AQP4 protein was lower in neck electrical acupuncture group than in the model group.Compared with those in the sham group，the expression of AQP4 mRNA and AQP4 protein increased significantly in the model group（P＜0.01），and the brain water content showed the same trend.Conclusion: Neck electrical acupuncture can significantly restrain the AQP4 expression to reduce the content of AQP4 protein and alleviate cerebral edema after intracranial hemorrhage in rats so that to protect brain tissue.

【Key words】Neck electrical acupuncture；Intracerebral Hemorrhage；AQP4；Brain water content

中圖分類號:R245.9+7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1004-745X（2016）01-0048-03

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.017

*基金項目：北京市教育委員會面上項目（KM201410025015）

通信作者△（電子郵箱：drcuihai@163.com）

收稿日期（2015-10-19）