大承氣湯對膿毒癥小鼠肺血管通透性影響

胡星星　倪海濱　劉克琴　俞辰斌（江蘇省中西醫結合醫院，江蘇　南京　210028）

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大承氣湯對膿毒癥小鼠肺血管通透性影響

胡星星倪海濱△劉克琴俞辰斌
（江蘇省中西醫結合醫院，江蘇南京210028）

【摘要】目的觀察大承氣湯對膿毒癥小鼠肺血管通透性的影響，初步判斷其作用機理。方法60只小鼠隨機分成對照組、模型組和大承氣湯組。采用腹腔注射脂多糖（LPS）建立膿毒癥模型，并給予大承氣湯灌胃治療。分組處理后12 h，監測各組血漿腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）及血漿總蛋白，每組10只稱右肺濕干質量，左肺行切片病理觀察；每組另10只行肺泡灌洗，測灌洗液總蛋白，計算肺通透指數。結果模型組與大承氣湯組，肺濕干質量比、肺通透指數均較對照組升高（P＜0.05或P＜0.01），而大承氣湯組濕干質量比、肺通透指數較模型組水平低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；模型組與大承氣湯組TNF-α、IL-1β、IL-6水平較對照組升高，但較大承氣湯組明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論大承氣湯通過降低膿毒癥小鼠炎癥介質水平，改善肺血管通透性，對膿毒癥中肺臟起保護作用。

【關鍵詞】大承氣湯膿毒癥血管通透性全身炎癥反應綜合征腫瘤壞死因子-α白細胞介素-6

膿毒癥在創傷和感染等應激狀態下，腸道的屏障功能受損，使腸道內大量的細菌和內毒素經門靜脈及淋巴系統侵入血液循環，造成腸源性感染和內毒素血癥及其所激活的細胞因子毒性網絡，引起全身多器官功能衰竭，而肺臟的損傷發生早、病情嚴重，常是患者死亡的直接原因［1］。早期肺損傷是以通透性肺水腫為特征的一種臨床綜合征，其嚴重階段即是急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。ARDS早期的特征性表現為肺毛細血管內皮細胞與肺泡上皮細胞屏障的通透性增高，肺泡與肺間質內積聚大量的水腫液［2］。因此，如何減少膿毒癥患者肺毛細血管內皮細胞與肺泡上皮細胞屏障的通透性，減輕炎癥反應，是保護并治療肺損傷的關鍵［3］。

肺與大腸相表里是臟腑表里相合的重要內容。大腸的實熱積滯等病態可致腸腔內的細菌與毒素大量繁殖增加并吸收入血，通過腸源性內毒素導致損害。大承氣湯是著名方劑之一，由大黃、厚樸、枳實、芒硝組成，功能峻瀉熱結，主治陽明腑實喘滿證，對內毒素性急性肺損傷的炎癥細胞及其分泌的多種細胞因子具有免疫調節作用［4］。筆者通過研究大承氣湯對膿毒癥小鼠肺血管通透性影響，探討大承氣湯對急性肺損傷（ALI）/ARDS的治療作用以及作用機制，以期為大承氣湯用于臨床膿毒癥患者的救治提供依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物60只SPF級雄性BALB/c雄性小鼠，體質量20～25 g，10～12周齡，由江蘇省中醫藥研究研動物中心提供。

1.2試藥大承氣湯組成大黃12 g，厚樸15 g，枳實15 g，芒硝9 g，藥材均購自江蘇省中醫藥研究院中藥庫房，水煎濃縮至102 mL（含生藥0.5 g/mL），經0.45 μm濾膜過濾除菌。脂多糖（LPS，Escherichia coli 055:B5，L2880），購自美國Sigma公司。生理鹽水溶解稀釋成1 mg/mL，即配即用。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）的ELISA測定試劑購自美國R&D公司。

1.3分組與造模60只小鼠隨機分成對照組、模型組和大承氣湯組，每組20只。所有實驗小鼠術前12 h禁食不禁水。模型組和大承氣湯組采用腹腔注射LPS 1 mL/10 g的方法制備小鼠膿毒癥模型，對照組予生理鹽水1 mL/10 g腹腔注射，0.5 h后予生理鹽水或大承氣湯灌胃。12 h后行相關標本采集。采用生理鹽水稀釋氯胺酮至20 mg/mL，按0.1 mg/g分別于造模給藥前及標本采集時小鼠后腿內側肌肉注射進行麻醉。

1.4標本采集與檢測

1.4.1血清中TNF-α、IL-1β、白介素-6（IL-6）小鼠麻醉后，開胸心臟采血約0.5 mL，3000 r/min離心10 min，取上層血清分裝于EP管置于-80℃冰箱，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，酶標儀（BIO-RAD680）讀取吸光度，根據標準曲線得出血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.4.2肺組織濕/干質量比每組隨機取10只小鼠，開胸留取左肺，濾紙拭去表面血跡并以電子天平稱重記錄。稱肺組織濕質量后，置烤箱80℃烘烤72 h，稱干質量，計算濕/干質量比值。取右肺邊緣組織約100 mg，磷酸鹽緩沖液（PBS）快速沖洗后濾紙吸干表面水分，浸泡于10%甲醛溶液24 h備用。余右肺組織立即置液氮凍存，-80℃冰箱備用。

1.4.3肺血管通透指數（LPI）的測定每組另取10只小鼠，開胸后暴露主氣管，將2 mL空針帶1 mL生理鹽水連接22號穿刺針，自頭側向尾側刺入氣管，回抽見氣泡確定針頭置入氣道內，結扎固定。更換1 mL注射器緩慢向氣道內注入生理鹽水1 mL，停留5 s后緩慢回抽，重復灌洗3次。回收灌洗液行1000 r/min離心10 min，取上清液應用全自動生化儀測定總蛋白濃度，肺泡灌洗液總蛋白濃度，計算LPI（肺泡灌洗液總蛋白濃度/血漿總蛋白濃度）。

1.5統計學處理采用SPSS13.0統計軟件。所有測定計量資料用（）表示，各組數據比較采用獨立樣本t檢驗，不同指標比較采用線性回歸，并采用單因素方差分析及多樣本均數的配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組小鼠血漿TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

見表1。與對照組相比，模型組、大承氣湯組小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）；大承氣湯組TNF-α、IL-1β、IL-6水平，較模型組降低（P＜0.05）。

表1　各組小鼠血漿TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

表1　各組小鼠血漿TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別n　IL-6大承氣湯組　20　236.81±13.96*△對照組　20　98.25±12.37模型組　20　311.28±15.72**TNF-α　IL-1β 93.47±9.87*△　23.54±3.77**△40.31±3.15　15.34±2.18 128.57±15.39**47.15±4.89**

2.2各組小鼠LPI比較見表2。與對照組相比，模型組、大承氣湯組小鼠LPI水平明顯升高（P＜0.01），大承氣湯組較模型組降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2　各組小鼠LPI比較

表2　各組小鼠LPI比較

組別n　LPI大承氣湯組10　2.73±0.43△△△對照組　10　1.20±0.19模型組　10　4.04±0.98**肺泡灌洗液總蛋白血漿總蛋白117.50±31.48　43.02±6.34 57.82±9.21　48.35±8.89 169.32±38.79　41.89±4.09

2.3各組小鼠肺濕干質量比比較見表3。與對照組相比，模型組、大承氣湯組小鼠肺濕干質量比升高，差異具有統計學意義（P＜0.01）。大承氣湯組較模型組肺濕干質量比降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.4各組小鼠肺組織病理切片見圖1。光鏡觀察可見大承氣組可減輕LPS導致肺血管通透性增加，改善肺損傷。

表3　各組小鼠肺濕質量、肺干質量、肺濕干質量比較

表3　各組小鼠肺濕質量、肺干質量、肺濕干質量比較

組別　n　肺濕干質量比大承氣湯組　10　4.89±0.52**△對照組　10　4.10±0.36模型組　10　5.53±0.97**肺濕質量（g）肺干質量（g）68.39±9.03　13.98±1.48 55.34±3.24　13.49±1.16 79.03±11.51　14.29±1.69

圖1　各組小鼠肺組織病理切片（HE染色，400倍）

3　討論

炎癥反應是機體對抗感染、創傷、缺血、燒傷、有毒物質、外來抗原和自身免疫過程中的保護機制。但在嚴重創傷、感染、應激狀態下，過度的炎癥反應造成血管內皮細胞損傷和微血管損傷。而這種損傷導致腸道屏障功能降低，腸源性內毒素甚至細菌移位入血，激活單核巨噬細胞等炎癥細胞，促使炎癥細胞因子（如TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6）過度釋放，形成瀑布式的炎癥反應放大效應，造成全身各臟器損傷［5］。而肺部由于毛細血管網極其豐富，肺循環收集濾過全身血液，因此成為最易受損的靶器官［6］。其功能、形態學改變往往最先發生，表現為呼吸急促，氧合功能下降，肺部血管通透性增加，肺泡內滲出增多，如全身炎癥反應不能得到即使控制，則進展為ARDS。

因此，在嚴重誘發因素作用下導致的腸源性內毒素移位入血，是加重SIRS，導致ARSD，進展為MODS的重要病理基礎［7］。這一理論與中醫“肺與大腸相表里”的機制相吻合。當機體遭受嚴重打擊后，外邪入侵，正氣受損，腸道屏障功能受損，腸道內細菌入血并釋放大量內毒素，邪毒亢盛，火熱循經上炎，熱滯于肺，阻遏三焦氣機，灼傷氣陰，血瘀氣滯，肺失宣降，為陽明腑實喘滿證，直至內閉外脫，甚至死亡［8］。

LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，與受體作用幾小時內觸發單核細胞和巨噬細胞，引起多種炎癥介質和細胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6等的表達，再通過旁分泌或體循環作用于其他組織細胞，引發內毒素血癥，因此小鼠腹腔注射LPS可復制內毒素血癥的經典模型。

本研究發現，小鼠在腹腔注射LPS 12 h后血漿、肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6均較對照組出現明顯增高，肺濕干質量比增加，肺血管通透指數升高，提示膿毒癥可導致肺血管通透性增加，而炎癥介質的釋放是導致肺損傷的主要原因。在大承氣湯組，本研究觀察到肺濕干質量比、LPI均較膿毒癥組輕微，同時血漿、肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6升高水平均較模型組偏低，可見大承氣湯具有改善膿毒癥小鼠肺血管通透性的作用，其作用機制可能與其對全身炎癥反應的抑制作用有關［9-10］。

本研究觀察到大承氣湯可降低膿毒癥小鼠肺血管通透性，降低炎癥介質水平，減輕全身炎癥反應。但具體作用機制、作用途徑尚未明確。另本研究為動物實驗，臨床使用過程中是否具有相似效果，有待后續研究進一步補充。

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中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:A

文章編號:1004-745X（2016）01-0089-03

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.029

通信作者△（電子郵箱：13951014020@163.com）

收稿日期（2015-09-12）