葶藶子水提液對內毒素致急性肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞水通道蛋白5表達的影響*

張朝暉　徐小云　瞿星光　鄒文博　李靈豐　曾超　姚玲　鐘建華（三峽大學第一臨床醫學院，湖北省宜昌市中心人民醫院，湖北　宜昌　443003）

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葶藶子水提液對內毒素致急性肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞水通道蛋白5表達的影響*

張朝暉徐小云△瞿星光鄒文博李靈豐曾超姚玲鐘建華
（三峽大學第一臨床醫學院，湖北省宜昌市中心人民醫院，湖北宜昌443003）

【摘要】目的觀察葶藶子水提液對內毒素致急性肺損傷大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞水通道蛋白5表達的影響。方法清潔級SD大鼠18只，隨機分成空白對照組、模型組、葶藶子治療組（治療組）共3組，尾靜脈注射內毒素建立急性肺損傷模型后4 h處死大鼠。計量24 h尿量，收集血液樣本，測定血氣分析，摘取肺臟，稱重并計算肺系數，HE染色法觀察肺組織病理，并采用免疫電泳法測定通道蛋白5（AQP5）的表達。結果模型組、治療組肺濕重、肺系數與空白對照組相比，肺濕重、肺系數差異均具有統計學意義（均P＜0.01）；治療組肺濕重、肺系數與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與空白對照組相比較，模型組大鼠24 h尿量有所減少，但差異無統計學意義（P＞0.05）；葶藶子治療組與模型組比較，大鼠24 h尿量差異有統計學意義（P＜0.01）。模型組、治療組與空白對照組相比，PaO2、PaCO2、pH均值差異均具有統計學意義（均P＜0.01）；治療組PaO2、PaCO2、pH與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。肉眼觀，與對照組比較，模型組大鼠雙肺充血水腫、肺外周可見片狀炎性滲出、體積明顯增大，肺泡呈粉紅色，氣管內有粉紅色分泌物溢出，或見血性胸水；模型組100倍鏡下示肺泡廣泛水腫及片狀炎細胞浸潤，局灶性出血，結構輪廓幾乎喪失，部分肺泡受壓萎陷。肉眼觀，治療組較模型組大鼠雙肺腫脹減輕，肺表面光滑，彈性可；光鏡下治療組肺泡可見充血水腫，炎細胞浸潤，肺泡結構及輪廓顯示不清，但較模型組明顯減輕，肺泡內水腫液明顯減少，僅見炎細胞浸潤。電泳結果示，模型組APQ5蛋白表達較對照組明顯下調（P＜0.01），與模型組比較，葶藶子治療組可明顯上調APQ5蛋白表達。結論葶藶子有改善急性肺損傷的效果，這種作用可能與其改善水通道蛋白5含量或者活性有關。

【關鍵詞】急性肺損傷葶藶子提取液水通道蛋白

急性肺損傷是一種以通透性肺水腫為特征的臨床綜合征，治療關鍵是清除肺泡水腫液。水通道蛋白（AQPs）是一種細胞膜轉運蛋白，與水通透性有關，急性肺損傷發生后AQPs表達下降，機體清除水腫液能力下降，水腫液在肺泡間質聚積而加重肺泡和間質內水腫。本實驗在筆者前期臨床研究基礎上，通過對大鼠ATⅡ進行分離和純化，觀察葶藶子水提液對急性肺損傷大鼠AQP5在ATⅡ上的表達的影響，從水通道角度研究葶藶子對急性肺損傷大鼠的作用及可能機制［1］，為臨床應用葶藶子治療急性肺損傷提供實驗依據。現報告如下。

1　材料與方法

1.1動物SPF級健康雄性SD大鼠，體質量180～200 g（由華中科技大學大學實驗動物中心提供）。大鼠自由飲水，常規適應性飼養1周后進行實驗。飼養條件：室溫20～26℃，相對濕度40%～70%。

1.2主要試劑小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；大鼠IgG（上海博蘊生物有限公司）；內毒素（LPS）（E．coil serotype 055：B5）；AQP5抗體（美國santa cruz公司）。其他試劑為國產分析純。葶藶子經鑒定為南葶藶子Descurainia sophia（L.）Webb ex Prantl，由中藥飲片有限責任公司提供。AQP5原位雜交試劑盒和免疫組化試劑盒（均由博士德生物工程有限公司提供）。

1.3葶藶子水提液的制備取8倍量70℃水浴提取葶藶子200 g 3次，每次1 h，合并濾液濃縮至100 mL 使1 mL相當于2 g原生藥。

1.4造模分組及給藥健康SD大鼠18只，禁食不禁水12 h后手術。隨機分為空白對照組、模型組、葶藶子干預治療組3組。模型組和治療組則分別經尾靜脈注射LPS建立急性肺損傷模型；治療組造模成功后給予葶藶子提取液1周，參考文獻［2］劑量15 g/kg。

1.5觀察指標1）干濕比重、尿量及血氣分析測定：給藥1周后將大鼠稱質量，禁食不禁水，置于代謝籠中24 h，收集尿液并計量；24 h后留取動脈血標本，進行血氣分析；處死大鼠后仰臥固定于解剖操作臺上，開胸暴露氣管，將左主支氣管結扎，全肺稱質量后計算肺系數（肺系數=全肺濕重/體質量×100%）。2）形態學研究：稱重后取左側肺組織固定于10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋，3 μm切片，行伊紅-蘇木素染色。3）肺臟AQP5蛋白表達：Western-blot法測定肺臟AQP5蛋白表達，分組各取右肺中葉組織勻漿提取肺組織蛋白，凝膠電泳分離蛋白、轉膜、封閉，一抗兔抗AQP5抗體（1∶1000；Cell Signaling Technology公司）；兔二抗（HRP標記羊抗兔IgG）37℃孵育1 h，化學發光，顯影、定影，凝膠成像系統行目的蛋白及內參條帶β-actin灰度分析，二者灰度比值為各蛋白表達強度。4）肺組織總蛋白：BCA試劑盒測定肺組織勻漿離心上清液中的總蛋白。5）腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平：ELISA法分別測定肺組織勻漿上清、BALF和血清中TNF-α（肺組織勻漿TNF-α=肺組織勻漿上清TNF-α/肺組織勻漿上清蛋白）。

1.6統計學處理應用SPSS 17.0統計軟件處理。計量資料以（±s）表示。多組間均數比較均采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠肺濕重、肺系數及24 h尿量比較見表1。結果示，模型組、治療組肺濕重、肺系數與空白對照組相比，肺濕重、肺系數差異均具有統計學意義（均P＜0.01）；治療組肺濕重、肺系數與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與空白對照組相比較，模型組大鼠24 h尿量有所減少，但差異無統計學意義（P＞0.05）；葶藶子治療組與模型組比較，大鼠24 h尿量差異有統計學意義（P＜0.01）。

表1　各組大鼠肺濕重、肺系數及24 h尿量比較（±s）

表1　各組大鼠肺濕重、肺系數及24 h尿量比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別　n　24 h尿量（mL）治療組　6　23.36±2.11*△△對照組　6　18.87±1.23模型組　6　12.48±0.29全肺濕重（g）　肺系數（%）3.03±0.21*△　1.00±0.09*△2.26±0.11　0.75±0.06 3.48±0.19**　0.33±0.04**

2.2各組血氣分析比較見表2。模型組、治療組與空白對照組相比，PaO2、PaCO2、pH均值差異均具有統計學意義（均P＜0.01）；治療組PaO2、PaCO2、pH與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2　各組血氣分析比較（±s）

表2　各組血氣分析比較（±s）

組別n　pH治療組　6　7.35±0.01*△對照組　6　7.39±0.05模型組　6　7.22±0.04**PaO2（mmHg）PaCO2（mmHg）86.05±2.34*△　46.07±3.15*△97.25±2.11　42.71±1.46 68.68±3.19**　66.32±3.24**

2.4各組病理形態學改變見圖1。肉眼觀，與對照組比較，模型組大鼠雙肺充血水腫、肺外周可見片狀炎性滲出、體積明顯增大，肺泡呈粉紅色，氣管內可見粉紅色分泌物，或見血性胸水；模型組100倍鏡下示肺泡廣泛水腫及片狀炎細胞浸潤，局灶性出血，結構輪廓幾乎喪失，部分肺泡受壓萎陷。肉眼觀，治療組較模型組大鼠雙肺腫脹減輕，肺表面光滑，彈性可；光鏡下治療組肺泡可見充血水腫，炎細胞浸潤，肺泡結構輪廓顯示不清，但較模型組明顯減輕，肺泡內水腫液明顯減少，僅見炎細胞浸潤。

圖1　各組病理形態學改變（HE，×100）

2.5各組APQ5蛋白免疫印跡電泳表達比較見圖2。電泳結果示，模型組APQ5蛋白表達較對照組明顯下調，與模型組比較，葶藶子治療組可明顯上調APQ5蛋白表達。

圖2　各組病理形態學改變

3　討論

一般認為，肺水腫主要由于肺泡上皮/微血管內皮屏障功能失調及肺泡間隙受損所致，而對AQPs調節水的轉運、維持肺液平衡的作用認識不足。

現已證實有4種（AQPI、3、4、5）水通道蛋白與急性肺損傷有密切關系，水通道蛋白，AQP5主要分布于肺毛細血管內皮細胞、肺泡I型上皮細胞和氣道上皮細胞上，研究證實AQP5敲除小鼠肺泡和毛細血管間的滲透性、水通透性均降低90%以上［4］，表明AQP5可能參與了急性肺損傷的發生。LPS致肺損傷動物模型研究發現，AQP1和AQP5表達下調［5］。王玨實驗研究表明，在模型組大鼠胸水中AQP1含量高于各治療組［6］。AQPs表達量或功能失調降低了肺損傷時其對肺組織中過多液體的清除能力，加重了肺泡和間質水腫，從而進一步影響AQPs表達，導致病情惡化。筆者實驗結果發現，在急性肺損傷大鼠肺臟中AQP5表達明顯低于正常大鼠，進一步證實了以上結論。

“葶藶子為肺家氣分藥，大瀉肺之力尤強”（《藥性論》）。北宋《開寶本草》述該藥為“療肺壅上氣咳嗽，止喘促，除胸中痰飲”。李時珍曰“肺中水氣賁郁滿急者，非此不能”。可見葶藶子以通利水道善治一身上下內外之水氣留滯之病為特長。藥理研究證實［7-8］，葶藶子以其利尿作用，從而達到降低靜水壓的效果，根據Starlnig定律不難推測，葶藶子可以增加肺泡至肺毛細血管的液體的通透性。前期筆者采用葶藶子為君藥的葶藶大棗瀉肺湯在ICU中治療胸腔積液、肺水腫、腦水腫等危重病患者，均取得了良好的療效［9-11］；在筆者的研究也發現葶藶子不僅可以顯著減輕肺水腫及肺瘀血，而且改善了肺損傷大鼠的動脈血氣。

中醫學認為傷津、耗液，不僅是水分的消耗，也可使正氣受損導致組織細胞功能受損，甚至形態結構改變。肺之“輸布津液”與“宣發肅降”功能與氣管黏液分泌、肺泡腔和血管腔間水的轉運及選擇性轉運水液的AQPs與津液代謝相關，表明AQPs可能是中醫學津液病證產生的分子學基礎之一［11-13］。本研究結果示，葶藶子治療組肺水腫效果明顯，AQP5蛋白表達增加，表明AQP5可能參與了肺水腫的發病，而葶藶子改善肺損傷可能通過上調AQP5表達發揮作用。

綜上所述，針對LPS誘導的急性肺損傷，葶藶子提取液有效地改善了急性肺損傷引起肺淤血、肺水腫及動脈血氣改變；這種效果可能與其改善水通道蛋白5含量或者活性有關。

參考文獻

［1］馬梅芳，呂文海.葶藶子近30年研究進展［J］.中醫藥信息，2005，22（5）：35-36.

［2］周澤斌，劉素君，王應，等.葶藶子水提液對CHF大鼠利尿作用的影響［J］.中國現代應用藥學，2010，27（3）：211-213.

［3］Krane CM.Aquapoein 5-deficient mouse lungs are hyperre2sponsive to cholinergic stimulation［J］.Proc Natl Acad Sci，2001，98（3）：14114-14119.

［4］Jiao GY，Li ER，Yu RJ．Decreased expression of AQP1 and AQP5 in acute injured lung in rats［J］．Chin Med J，2002，115 （7）：963-967.

［5］江蘇新醫學院編.中藥大辭典（下冊）［M］.上海：上海科學技術出版社，1986：2320.

［6］王玨.瀉肺逐飲湯對惡性胸腔積液大鼠TGF-β1、AQP1、CTLA-4和PFP的影響［D］.哈爾濱：黑龍江中醫藥大學，2012.

［7］南京藥學院.中草藥學（中冊）［M］.南京：江蘇人民出版社，1976：370.

［8］許銀姬，陳遠彬，王麗麗，等.青天葵對內毒素致急性肺損傷大鼠肺水通道蛋白1和5表達的影響［J］.中國中西醫結合雜志，2010，28（6）：163-165.

［9］周剛，張朝暉.ICU中應用葶藶大棗瀉肺湯治療危重癥［J］.遼寧中醫藥大學學報，2011，13（2）：108.

［10］夏昔.葶藶大棗瀉肺湯在治萬中毒性肺水腫中的應用［J］.上海中醫藥雜志，1993，39（8）：23-25.

［11］胡利群，丁建中.水通道蛋白與肺部疾病研究進展［J］.長江大學學報：自然科學版，2008，5（4）：83-86.

［12］楊光，林明俠，萬羽.葶藶子的藥理作用及臨床應用概況［J］.中醫藥信息，2001，18（2）：12-13.

［13］馬梅芳，呂文海.葶藶子近30年研究進展［J］.中醫藥信息，2005，22（5）：35-36.

·研究報告·

·研究報告·

Effects of Semen Lepidii on the Expression of Aquaporin-5 of Alveolar Cells TypeⅡin Rats with Endotoxin Induced Acute Lung Injury

ZHANG Zhaohui，XU Xiaoyun，QU Xingguang，et al.Department of ICU，the First College of Clinical Medical Science，Three Gorges University & Yichang Central People′s Hospital，Hubei，Yichang 443003，China.

【Abstract】Objective：To observe the effect of semen lepidii on the expression of aquaporin-5 of alveolar cells typeⅡin rats with endotoxin induced acute lung injury.Methods：18 Clean SD rats were randomly divided into the control group，the model group and lepidii group.The model of acute lung injury was established with tail vein injection of endotoxin，and the rats were executed 4 hours after successful modeling.24 hours urine output was measured.The blood was collected and blood gas analysis was detected.Both lungs were removed and weighed.The lung coefficient was calculated.HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue and the expression of AQP5 was detected with the method of immuno electrophoresis.Results：Compared with the control group，there was statistical significance in the level of lung wet weight and lung coefficient of the model group and lepidii group（P＜0.01），as well as in the comparison of lepidii group and the model group（P＜0.05）.Compared with the control group，24 hours urine output of the model group decreased a little，without statistical significance（P＞0.05）.However，it was opposite in the comparison between the lepidii group and the model group （P＜0.01）.The mean difference in PaO2，PaCO2and PH among the three groups had statistical significance（P＜0.01），as well as in the comparison of lepidii group and the model group（P＜0.05）.Gross appearance showed that compared with the control group，there was congestion and edema in both lungs and patchy inflammatory exuda-tion in peripheral lung in the model group；volume increased significantly with pink alveolar，pink secretion from airway and maybe bloody pleural fluid.100 times under the light microscope，there was alveolar edema，patchy inflammatory exudation and focal hemorrhages；structure outlines were almost lost；part of alveolar collapsed because of pressure.Gross appearance showed that compared with the model group，edema in both lungs relieved with smooth surface and resilience.Under the light microscope，there was congestion and edema in alveolar，inflammatory exudation，vague outlines in lepidii group.However，compared with the model group，the alveolar edema was significantly decreased，only seeing inflammatory exudation.Electrophoresis results showed that the drop of APQ5 expression in the model group was more obvious than that of the control group（P＜0.01），and compared with the model group，the increase of APQ5 expression in lepidii group was more obvious.Conclusion：Lepidii can improve acute lung injury，which may be related with its improvement on the content or activity of aquaporin-5.

【Key words】Acute lung injury；Semen lepidii；Aquaporin

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）04-0606-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.012

*基金項目：湖北省宜昌市科技攻關項目

通信作者△（電子郵箱：1410956890@qq.com）

收稿日期（2015-11-02）