針刺夾脊穴及督脈穴對急性脊髓損傷神經傳導通路影響的研究*

陳榮良　杜偉斌　全仁夫（浙江中醫藥大學附屬江南醫院，浙江　杭州　311201）

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針刺夾脊穴及督脈穴對急性脊髓損傷神經傳導通路影響的研究*

陳榮良杜偉斌全仁夫△
（浙江中醫藥大學附屬江南醫院，浙江杭州311201）

【摘要】目的探討針刺夾脊穴及督脈穴對急性脊髓損傷神經傳導通路的影響和作用機制。方法取健康清潔級新西蘭兔80只，將其按隨機數字表法隨機分為5組，分別為正常對照組、模型對照組、假手術組、針刺穴位組、甲基強的松龍（MP）療法組，每組16只，造模成功后進行MR檢測鑒定。正常對照組、模型對照組、假手術組不予任何治療。針刺組、MP沖擊療法組采用改良Allens法制作脊髓中度損傷模型后，針刺組給予夾脊穴及督脈穴電針治療，采用連續脈沖，頻率2 Hz，輸出電流0.6～1 mA，每次30 min，每日1次，共7次；MP療法組造模后即按30 mg/kg首劑靜注1次，1 h后即開始應用按5.4 mg/kg計算23 h總量，分4次靜脈注射。1周后對各組兔子進行一般行為，神經功能，損傷截段HE染色，辣根過氧化物酶（HRP）逆行示蹤評價和對比。結果在精神狀況、反應能力、活動度方面，術后7 d時正常對照組、假手術組動物均基本恢復至術前水平，針刺穴位組較MP療法組、模型對照組恢復狀況要好，差異有統計學意義（P＜0.05）。正常對照組Reuter評分無變化，假手術組術后7 d恢復到術前水平；模型對照組、MP療法組、針刺穴位組術后7 d Reuter評分均降低，針刺穴位組與模型對照組、MP療法組比較降低更加明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。急性脊髓損傷7 d后，HRP呈藍黑色表達于脊髓灰質中，相較于模型組，針刺組與MP組明顯使受損脊髓組織表達更多，但可能是時間原因，仍無法達到假手術組水平，提示針灸對脊髓神經通路的再通是有一定作用的；與此同時，針灸組與MP組比較，無明顯差異。而HRP陽性表達強度的光密度值與HE染色結果吻合。結論針刺能明顯改善急性脊髓損傷的神經和運動功能，其機制可能為調節紅核神經元細胞，使得損傷截段神經通路修復而產生作用。

【關鍵詞】針刺脊髓損傷神經傳導夾脊穴督脈穴

脊髓損傷是臨床上常見而嚴重的神經系統疾病，臨床表現主要為神經功能障礙如大小便失禁等，嚴重者可引起不同程度的截癱，甚至危及生命［1-2］。據世界衛生組織調查顯示，外傷性脊髓損傷的年發病率逐年上升［3］。近年來，運用中醫藥手段研究神經退行性疾病也日益增多［4］。本實驗以針刺夾脊穴與督脈穴，觀察干預后兔子神經運動功能變化，紅核神經元細胞逆行性損傷情況，探討針刺對脊髓損傷功能的影響及可能的作用機理。

1　材料與方法

1.1實驗動物

純種健康新西蘭家兔80只，雌雄各半，體質量2.5～3.5 kg，購自浙江中醫藥大學動物實驗中心，適應性飼養1周，分組實驗。

1.2主要試劑與儀器

一次性華佗牌針灸儀、電針儀（蘇州醫療用品廠），辣根過氧化物酶（HRP）（sigma公司），甲醛、二甲苯、無水乙醇、30%H2O2（上海國藥集團），BSA（北京索萊寶生物科技有限公司），DAB濃縮型試劑盒（上海長島生物技術有限公司），中性樹脂（上海長島生物技術有限公司），PBS（磷酸鹽緩沖液）固定液。

1.3動物分組與造模

將80只新西蘭家兔按隨機數字表法隨機分為5組，每組16只，具體分組為正常對照組、模型對照組、假手術組、針刺穴位組、MP療法組。造模方法：采用改良Allens法及參考文獻［5-6］制作脊髓中度損傷新西蘭家兔模型。術區常規剪毛、消毒、耳緣靜脈注射烏拉坦麻醉急性脊髓損傷新西蘭家兔后，取俯臥位，背部正中切開，以T13為中心，暴露一個椎體，咬除T13～L1棘突及椎板，暴露0.5 cm寬硬膜。用克氏針（質量10 g）沿導管從80 mm高處垂直自由下落，打擊在薄塑料材料制成的半圓片（直徑4 mm、寬2 mm）上，造成脊髓后角中度損傷。打擊成功后逐層縫合。術后每天采用Crede手法按摩新西蘭家兔腹部，輔助排便、排尿2～4次，同時青霉素80萬U，肌注，連續2 d。

1.4動物干預

正常對照組：正常新西蘭家兔，喂飼標準飼料，不予任何處理，共觀察1周；模型對照組：復制急性脊髓損傷新西蘭家兔模型，每天肌注青霉素80萬U，連續2 d，預防創口感染，喂飼標準飼料，共觀察1周；假手術組：常規手術咬除新西蘭家兔T13～L1棘突及全部椎板，暴露寬硬膜，不予撞擊脊髓及電刺激，喂飼標準飼料，每天肌注青霉素80萬U，連續2 d，預防創口感染，共觀察1周；針刺組：急性脊髓損傷新西蘭家兔模型建立后每日給予1次針刺治療，用毫針選取相應穴位針刺（選取受損脊髓節段上下兩對夾脊穴及督脈穴），進針采用手法進針結合韓氏治療儀進行1次電針治療：每次治療時間30 min，采用頻率2 Hz，電流0.6～1 mA的連續脈沖，；喂飼標準飼料，每天肌注青霉素80萬U，連續2 d，預防創口感染，共觀察1周；甲基強的松龍（MP）療法組：急性脊髓損傷新西蘭家兔造模后即按30 mg/ kg首劑靜注MP 1次，1 h后即開始應用按5.4 mg/kg計算23 h總量，分4次靜脈注射，不予針灸治療；喂飼標準飼料，每天肌注青霉素80萬U，連續2 d，預防創口感染，共觀察1周。

1.5模型檢測與方法

術后行脊髓MRI掃描。造模得到正常對照組、假手術組Tarlov評分為5分，MRI顯示T13的T2WI信號正常，可見清晰的腦脊液通過；模型對照組、針刺穴位組、MP療法組Tarlov評分為0分，MRI顯示在脊髓T13損傷周圍T2WI明顯的高信號，表明脊髓斷端周圍充血、水腫，表明脊髓損傷造模成功。

1.6檢測指標與方法

1.6.1新西蘭家兔的一般行為學觀察實驗開始后每天觀察大白兔的精神狀況、反應能力、活動度、攝食量、攝水量以及存活數等。

1.6.2新西蘭家兔的神經功能評分1）采用改良Tarlov評分法［7］，對兔后肢運動功能進行評定，評分前所有動物均檢查膀胱是否充盈，防止因膀胱充盈而影響活動。評分采用雙人、雙盲法，評分者為非本實驗組人員且熟知評分標準，每人分別對兔一側后肢獨立進行功能評估，每項指標共測定3次，取平均值；2）根據Reuter脊髓感覺運動反射功能評分方法［8］，對各組兔術后脊髓感覺、運動反射功能進行評分，具體標準如下。牽張反射：正常0分；輕微增強/減弱1分；亢進/消失2分。疼痛回縮反射：快速0分；遲緩1分；消失2分。背部感覺：完全0分；部分1分；消失2分。肌張力：正常0分；低張力/高張力1分；遲緩/痙攣2分。運動能力：能行走0分；僅能站立1分；能隨意移動后肢2分；不能隨意移動后肢3分。

1.6.3新西蘭家兔脊髓組織病理學各組于實驗7 d后采取標本，對新西蘭家兔切開左心室及右心房，從左心室沿主動脈方向插管，快速灌入生理鹽水直至回右心房的灌注液清亮，再快速灌入4%的多聚甲醛PD液，流量控制在50 mL/min，灌注3～4 min，接著以10 mL/min，維持灌注20 min，取出T13～L1椎體對應節段脊髓1 cm，給予標號，進行相關指標檢測。采用常規光學顯微鏡和電子顯微鏡觀察新西蘭家兔T13～L1節段脊髓組織的病理形態學變化。

1.6.4HRP逆行示蹤實驗7 d后動物被麻醉后，仔細分離標本肌肉尋找坐骨神經，用眼科鑷輕輕托起坐骨神經，用微量注射器慢慢注入30%HRP 5 μL左右，留針10 min 24～48 h后，取脊髓橫斷傷上端靠近損傷處脊髓。4%多聚甲醛固定8～12 h后冷凍切片，行HRP-DAB-硫酸鎳胺增強法顯色。光學顯微鏡下200倍下讀片，觀察脊髓橫斷面上HRP陽性表達強度，對7 d后的切片隨機抽取5張進行進行光密度值計數。

1.7統計學處理

2　結果

2.1各組行為學及神經功能評分

見表1。實驗動物在術后首日因麻醉、驚嚇等原因普遍精神較差，后各組實驗動物、攝食量、攝水量均不同程度好轉，無實驗動物死亡。在精神狀況、反應能力、活動度方面，實驗7 d時正常對照組、假手術組動物均基本恢復至術前水平，針刺穴位組較MP療法組、模型對照組恢復狀況要好，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1　各組各時間點Tarlov評分比較（分，±s）

與模型對照組比較，*P＜0.05；與MP組療法比較，△P＜0.05。下同。

組別n　術后7 d正常對照組　16　5.00±0.00假手術組　16　4.86±0.33模型對照組　16　1.38±0.48術后1 d　術后3 d 5.00±0.00　5.00±0.00 4.75±0.43　4.75±0.43 0.25±0.43　1.00±0.50 MP療法組　16　2.25±0.43 0.13±0.33　1.38±0.48針刺穴位組　16　0.13±0.33　1.50±0.50　2.63±0.48*△

2.2各組Reuter脊髓感覺運動反射功能評分結果比較

見表2。結果示正常對照組Reuter評分無變化，假手術組術后7 d恢復到術前水平；模型對照組、MP療法組、針刺穴位組術后7 d Reuter評分均降低，針刺穴位組與模型對照組、MP療法組比較降低更加明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2　各組各時間點Reuter評分比較（分，±s）

表2　各組各時間點Reuter評分比較（分，±s）

組別n　術后7 d正常對照組　16　0.00±0.00假手術組　16　0.00±0.00模型對照組　16　8.00±0.72術后1 d　術后3 d 0.00±0.00　0.00±0.00 1.00±0.50　0.38±0.48 9.50±1.32　8.63±0.86 MP療法組　16　6.25±0.66 9.38±1.32　7.34±0.70針刺穴位組　16　9.38±1.22　6.88±0.71　5.23±0.68*△

2.3各組脊髓病理結果

HE染色結果提示假手術組與正常對照組無明顯區別。模型組損傷明顯，脊髓組織正常結構喪失，可見片狀出血、水腫、壞死區，部分尼氏小體消失，灰質中可形成微小空腔，部分甚至有較大的空腔，有膠質細胞增生，局部損傷區域淋巴細胞浸潤；與模型組相比，MP組使用了甲強龍沖擊療法后，組織碎裂未見明顯改善，仍有少許出血及炎性細胞浸潤；與針刺組比較，神經元細胞留存相對減少，膠質細胞增生增加，提示針灸修復/保存神經元細胞方面有優勢。

2.4各組HRP表達結果

術后7 d，正常對照組、假手術組、模型對照組、MP療法組、針刺穴位組HRP表達光密度值分別為（591.23± 46.98）、（576.45±47.63）、（437.86±46.17）、（515.13±40.49）、（502.36±46.59）。提示在急性脊髓損傷7 d后，HRP呈藍黑色表達于脊髓灰質中，相較于模型組，針刺組與MP組明顯使受損脊髓組織表達更多，但可能是時間原因，仍無法達到假手術組水平，提示針灸對脊髓神經通路的再通是有一定作用的；與此同時，針灸組與MP組比較，無明顯差異。而HRP陽性表達強度的光密度值與HE染色結果吻合。

3　討論

目前臨床尚無一種方法能夠完全治愈脊髓損傷所造成的后遺癥［9］，脊髓損傷修復的研究策略主要包括藥物治療、組織移植治療、細胞移植治療等，但都有其局限性［10-14］。大劑量MP療法在以往臨床中被用作治療急性脊髓損傷的首選，但隨后也有研究結果顯示，MP治療急性脊髓損傷療效較弱。進而尋求一種可接受性強，無明顯毒副作用等優點的治療手段越來越被探索。

脊髓損傷屬于中醫學“截癱”“痿證”等范疇，其病因病機認為是督脈受損。督脈損則氣亂血溢，手足三陽經氣不通，陽氣不達四末，筋經失養，而見肢體麻木，不能活動等征象［15］。脊髓損傷以后，紅核脊髓束可以產生延遲性的變性壞死，進而紅核神經元發生凋亡，這種延遲性的逆行性中樞神經元損傷嚴重影響了脊髓神經功能的恢復。HRP逆行示蹤技術可以對脊髓損傷后的神經修復狀況進行可靠的形態學評判［16-17］。

本實驗選取損傷節段上下的兩對夾脊穴及上下兩個督脈穴，他們分別屬于節段疊加配穴范疇和中軸貫通配穴范疇［18-19］，對上述穴位進行有效針刺并加以電刺激。結果顯示，由于脊髓損傷，逆行性地使紅核神經元細胞受損，兔子的神經功能受到了嚴重破壞。而針刺激組經過1周的干預，HRP逆行標記的細胞要明顯多于其他組別。HE染色也同時驗證了針刺激組的出血、水腫、壞死區得到了更好的緩解和修復。干預1周時，針刺激組行為功能，神經功能恢復也同時優于其他組別，這也間接提示了紅核損傷程度與行為功能恢復的相關性。究其可能的作用機制，也許是電刺激通過上下節段的神經根穿越損傷脊髓的外圍，并又將電流貫通損傷脊髓區域，從而抑制紅核神經元細胞的凋亡，促進神經通路修復和再生的反饋調節作用。

綜合上述，本研究通過針刺夾脊穴及督脈穴治療急性脊髓損傷發現，其可有效改善急性脊髓損傷的神經和運動功能。其作用機制可能是阻斷逆行性中樞神經元損傷途徑，抑制紅核神經元細胞的凋亡，使得損傷截段神經通路修復而產生作用。但是，脊髓損傷的修復畢竟是一個多系統的復雜過程。這需要我們深入研究，發揮中醫藥、針灸的作用優勢，更進一步研究其更加具體可靠的作用機制，并為臨床治療提供有效的實驗依據。

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Study on the Effects of Needling Hua Tuo Jiaji Points and Du Meridian Points on Acute Spinal Cord Injury（sci）Nerve Conduction Pathway

CHEN Rongliang，DU Weibin，QUAN Renfu.Xiaoshan Chinese Medicine Hospital Affiliated to Zhejiang University of Chinese Medicine，Zhejiang，Hangzhou 311201，China.

【Abstract】Objection：To explore the effects and mechanism of needling Hua Tuo Jiaji points and Du meridian points on acute spinal cord injury（sci）nerve conduction pathway.Methods：80 health clean New Zealand rabbits were randomly divided into 5 groups according to random number table method：the normal control group，the model control group，sham operation group，acupuncture group and MP shock therapy group，16 cases in each.After establishing models，MR detection identification was taken.The normal control group，the model control group and sham operation group will not take any treatment.The spinal cord injury model was made with modified Allens method in MP shock therapy group，while the acupuncture group was treated by Electroacupuncturing Hua Tuo Jiaji points and Du meridian acupuncture points，with continuous pulse，frequency of 2 hz and output current 0.6～1 mA for 30 min，once a day for seven days.MP shock therapy group took 30 mg/kg first agent static note 1 time after established models，1 h after the start application according to 5.4 mg/kg to calculate total 23 h，intravenous four times.1 week later，the rabbit general behavior，nerve function and HE staining of damage the cut section，HRP retrograde tracer of each groups were evaluated and compared.Results：1 week later，general behavior of each group was improved.For neural function，Acupuncture and MP groups were obviously better than the control group（the difference was statistically significant，P＜0.01）.HE staining showed hemorrhage，edemaand necrosis area of the acupuncture group were obviously better than those of the model control group and neurons and glial cells were improved.HRP retrograde tracer in the acupuncture group and MP group was better than that of the model group，and absorbance difference was statistically significant compared with the model group（P＜0.05）.Conclusion：Acupuncture can obviously improve the acute spinal cord injury of nerve and motor function，whose mechanism may be to adjust the red nucleus neurons and finnaly make the damage cut section of the neural pathways repair.

【Key words】Acupuncture；Spinal cord injury；Nerve conduction；Hua Tuo Jiaji points；Du meridian points

中圖分類號：R246

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）04-0619-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.016

*基金項目：浙江省杭州市醫療衛生及重點?？茖２】蒲泄リP專項（20140733Q43）；浙江省杭州市蕭山區科技局社會發展類重大項目（2013313）

通信作者△（電子郵箱：quanrenfu@126.com）

收稿日期（2015-09-02）