疏肝和胃方對胃食管反流大鼠模型背根神經節中TRPV1表達的影響*

曹會杰　劉春芳　程艷梅　張秀蓮　王宏偉　朱生樑△（.上海中醫藥大學附屬普陀醫院，上海　0000；.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海　00437）

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疏肝和胃方對胃食管反流大鼠模型背根神經節中TRPV1表達的影響*

曹會杰1劉春芳2程艷梅2張秀蓮2王宏偉2朱生樑2△
（1.上海中醫藥大學附屬普陀醫院，上海200002；2.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院，上海200437）

【摘要】目的觀察疏肝和胃方對胃食管反流大鼠模型背根神經節中內臟敏感因子瞬時受體電位香草酸亞型1（TRPV1）表達的影響，探討其治療胃食管反流病的機理。方法將40只SD大鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組、中藥組及西藥組，每組10只，除正常組外均行賁門肌切開術加幽門半結扎術制備反流性食管炎模型，并分別給予相應干預措施。免疫組化法及實時熒光定量核酸擴增檢測（QPCR）方法觀察各組大鼠背根神經節TRPV1受體及TRPV1 mRNA的表達。結果與正常組相比，模型組、西藥組大鼠背根神經節中TRPV1陽性表達明顯增高（P＜0.05）；中藥組與正常組比較無統計學差異（P＞0.05）；與西藥組比較，中藥組TRPV1陽性表達明顯降低（P＜0.05）。模型組背根神經節組織中TRPV1 mRNA表達水平明顯高于正常組、中藥組及西藥組（P＜0.05）；中藥組、西藥組與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；中藥組與西藥組比較，兩組背根神經節組織中TRPV1 mRNA表達差異無統計學意義（P＞0.05）。結論疏肝和胃方可能通過抑制TRPV1過度表達來發揮其治療胃食管反流病的作用。

【關鍵詞】胃食管反流病反流性食管炎瞬時受體電位香草酸亞型1（TRPV1）疏肝和胃方

胃食管反流病是指胃內容物反流入食管、口腔（包括喉部）或肺所致的癥狀和（或）并發癥［1］。目前認為，內臟敏感因子瞬時受體電位香草酸亞型1（TRPV1）在胃食管反流病的發病中發揮著重要作用。食管炎患者TRPVl在食管乳頭部的表達與反酸等癥狀顯著相關［2］。疏肝和胃方（柴胡、枳殼、旋覆梗、代赭石、香附、煅瓦楞、延胡索、太子參、黃連、吳茱萸、甘草）是上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院胃食管反流病專科門診長期應用的經驗方，其治療胃食管反流病臨床效果顯著［3］。本研究觀察了疏肝和胃方對胃食管反流大鼠模型背根神經節TRPV1受體及TRPV1 mRNA表達的影響，以闡述其治療胃食管反流病的作用機制。現報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠40只，健康雄性，體質量（250±20）g，由上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院實驗動物中心提供，上海市斯萊克實驗動物有限責任公司生產（動物許可證號SCXK（滬）2012-0002）。常規飼養。

1.2試劑與儀器兔抗TRPV1一抗、羊抗兔IgG二抗、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司；0.5%伊紅、蘇木素、二甲苯、梯度酒精由上海市制藥七廠生產；0.01 mol/L檸檬酸鈉抗原修復液、3%過氧化氫由上海天賀生物有限公司提供；微量樣本RNA提取試劑盒（DP420）、DEPC H2O（750024）、逆轉錄酶（R250-01）、熒光染料SYBR Green I（CS7561）、Rnase Inhibitor （E00381）、oligodT/Randomprimer/特異性引物、100 mM dNTPs（18427 013）、Platinum Taq DNA Polymerase均購自Invitrogen公司。半自動脫水機TP1020（Leica）、全自動石蠟包埋機EG1150（Leica）、全自動石蠟切片機RM2235（Leica）、光學顯微鏡H550S（Nikon Eclipse 50 i）、計算機圖像分析系統（IPWIN60）、高速冷凍離心機Neofuge13R（Heal Force）、生物安全柜HFsafe 1200 A2 （Heal Force）、熒光定量PCR儀CFX96TM型（Bio Rad）。疏肝和胃方藥物組成：旋覆梗12 g，代赭石15 g，柴胡9 g，枳殼12 g，香附9 g，煅瓦楞30 g，延胡索9 g，太子參9 g，黃連3 g，吳茱萸3 g，甘草6 g。采用中藥顆粒劑（由本院藥劑科提供），使用前配成溶液。奧美拉唑膠囊（由常州四藥生產，批號20130320，規格為20 mg/粒），使用前配成溶液。

1.3分組與造模40只SD大鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組、中藥組及西藥組，每組10只。除正常組外，其余3組大鼠均參照國內外文獻報道行賁門肌切開術加幽門半結扎術復制胃食管反流病模型［4-5］。

1.4給藥方法造模后1周，中藥組予疏肝和胃方顆粒劑，用前將顆粒劑配制成0.641 g/mL混懸液；西藥組予奧美拉唑膠囊，用前配制成0.208 mg/mL混懸液；每次按1 mL/100 g體質量，每日2次灌胃，連續14 d。模型組和正常組予等量0.9%氯化鈉注射液。各組于造模后第22日處死。

1.5觀察方法處死大鼠后，充分暴露胸椎段脊髓，將脊神經后段及其出椎管處膨大呈串珠樣的背根神經節取下，一部分置于4%多聚甲醛中，一部分儲存于-80℃冰箱。1）免疫組化法檢測大鼠背根神經節中TRPV1受體的表達。背根神經節置于4%多聚甲醛中4℃冰箱固定2 h；PBS沖洗3次；將組織塊浸入含20%蔗糖的PBS液4℃過夜，第2日包埋、冰凍切片，37℃溫箱30 min；常規二甲苯，乙醇脫蠟至水，PBS洗3×3 min；用0.01 mol/L檸檬酸鈉抗原修復液（pH6.0），煮沸熱修復（95℃15 min），保溫15 min，室溫自然冷卻，PBS洗3×3 min；3%H2O2抑制內源性過氧化物酶室溫孵育10 min；PBS洗3×3 min；10%正常胎牛血清室溫孵育30 min；PBS洗3×3 min；一抗4℃孵育過夜；PBS洗3×3 min；二抗37℃孵育1.5 h；PBS洗3×3 min；DAB顯色3～5 min；蘇木素復染30 s，鹽酸酒精分化1 s；脫水吹干后，樹脂封片。2）圖像分析。使用IPWIN60圖像分析系統。在Nikon光學顯微鏡高倍鏡（×400）下每張切片隨機選取3個視野進行觀察，并采集圖像，測定一定面積內，免疫組化圖像中陽性區域面積比以及光密度值（Optical Density）。免疫組化陽性指數=陽性面積比×平均光密度。3）QPCR法檢測大鼠背根神經節中TRPV1 mRNA表達。采用Tiangen公司DP420試劑盒進行RNA抽提，取50 μg左右組織，加入1 mL Trizol液，充分勻漿；22℃，靜置5 min，加入氯仿0.2 mL，顛倒15 s；22℃，靜置3 min；4℃×14000轉/min×15 min離心，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL異丙醇，混勻；22℃，靜置10 min；4℃×14000轉/min×10 min離心，棄上液，加入1 mL 4℃75%乙醇；4℃×10000轉/min× 5 min離心，棄上液，真空干燥5 min；用40 μL DEPC處理水溶解，-80℃保存。引物參照GenBank序列。RAT TRPV1上游引物5’-CGGTGGTGACGCTGATTG AAGAC-3’，下游引物5’-GTTGAGCA GGAGGATGTA GGTGAGA-3’，擴增片段177 bp采用熒光染料SYBR Green（CS7561）嵌合熒光法進行PCR擴增，儀器采用CFX96TM型實時熒光定量PCR儀。PCR反應條件為95℃10 s；95℃5 s；60℃20 s，40個循環。采用ΔΔCT法加以分析，以ddH2O作為陰性對照，樣本的相對表達量=2-ΔΔCT。

1.6統計學處理應用SPSS18.0統計軟件分析。符合正態分布以（x±s）表示，符合正態分布和方差齊性采用單因素方差分析，如不符合正態分布或方差齊性則采用秩和檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠背根神經節TRPV1陽性表達比較見表1，圖1。免疫組化結果顯示，TRPV1陽性表達于神經元的細胞質及細胞膜內，而細胞核無明顯表達。與正常組相比，模型組、西藥組大鼠背根神經節中TRPV1陽性表達明顯增高（P＜0.05）；中藥組與正常組比較無統計學差異（P＞0.05）；西藥組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與西藥組比較，中藥組TRPV1陽性表達明顯降低（P＜0.05）。

表1　各組大鼠背根神經節TRPV1陽性表達比較（x±s）

圖1　各組大鼠背根神經節TRPV1表達免疫組化圖（蘇木素，×400）

2.2各組大鼠背根神經節TRPV1 mRNA表達比較見表2。正常組大鼠背根神經節中含有少量的TRPV1 mRNA表達。模型組背根神經節組織中TRPV1的mRNA表達水平明顯高于正常組、中藥組及西藥組（P＜0.05）；中藥組、西藥組與正常組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；且中藥組與西藥組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2　各組大鼠背根神經節TRPV1 mRNA表達比較（x±s）

3　討論

TRPV1是一種非選擇性陽離子通道，主要表達于背根神經節中，也分布于胃腸道中，主要存在于傷害感受器上，參與炎性、機械性和溫度性的痛覺發生和痛覺過敏形成［6-7］。研究發現TRPV1參與了食管神經源性炎癥的發生，與P物質、降鈣素基因相關肽的釋放有關［8］。將人食管上皮細胞培養于酸化的細胞培養基中，模擬胃食管反流病中食管黏膜的酸暴露，可發現細胞中TRPV1 mRNA及其蛋白表達上調，同時細胞中巨噬細胞炎性蛋白-1α和單核細胞趨化蛋白-1等趨化因子的表達也相應增加，而應用TRPV1拮抗劑后趨化因子表達明顯降低［9］，這提示在食管酸暴露的情況下，TRPV1激活后會促進趨化因子釋放，進而加重食管黏膜炎癥。當食管黏膜長期暴露于酸環境中，食管內pH下降，進而激活了食管黏膜及周圍神經中的酸敏感離子通道，沿傳入神經傳至中樞神經，引起背根神經節中TRPV1的開放，TRPV1可將化學刺激、機械刺激等多種傷害性信號整合，尤其對痛覺信號更為敏感，TRPVl的開放導致痛覺閾值的降低，進一步導致傷害感受器興奮性升高，最終大腦中樞對感覺閾值進行下調，沿傳出神經傳出后使得患者對正常生理刺激或低強度的閾下刺激變得敏感。另外TRPV1激活還可促進神經源性炎癥神經肽的釋放，加劇炎癥反應。本研究中模型組大鼠背根神經節中的TRPV1含量較正常組明顯增高，從而表明在胃食管反流病的發病過程中，TRPV1受體水平的上調可導致食管高敏化，進而加重食管黏膜炎癥反應。

胃食管反流病屬于中醫學“食管癉”“吐酸”等范疇。疏肝和胃方乃緊切本病肝膽失于疏泄、胃失和降，胃氣上逆的基本病機組方而成，具有疏肝利膽、通降和胃的功效。方中柴胡、枳殼、代赭石、旋覆梗升降相因，共奏疏肝理氣、和胃降逆之效；黃連、吳茱萸寒熱并用，辛開苦降，清降肝胃郁火、制酸和胃；延胡索行氣止痛；香附配合柴胡等加強疏肝解郁，行氣止痛之效；煅瓦楞功在制酸止痛；太子參、甘草健脾養胃、調和諸藥。諸藥配伍從整體上協調各臟腑之間的功能，同時緊緊圍繞調節氣機，使肝膽脾胃中焦氣機歸于正常，邪去正安，則諸癥俱消。前期研究顯示，疏肝和胃方治療胃食管反流病具有良好療效［3］，且對反流性食管炎大鼠模型食管黏膜炎癥具有明顯改善作用［10］，但其作用機制并不十分清楚。本實驗在上述基礎上，證明疏肝和胃方對胃食管反流病大鼠模型背根神經節中TRPV1的表達具有一定的調控作用，通過抑制TRPV1的高表達，使被激活或致敏的TRPV1恢復正常，減少痛覺的傳導，進而改善食管黏膜炎癥。

參考文獻

［1］atz PO，Gerson LB，Vela MF.Guidelines for the diagnosis and management of gasfoesophageal reflux disease［J］.Am J Gastroenterol，2013，108（3）：308-328．

［2］Matthews PJ，Aziz Q.Increased capsaicin receptor TRPV1 nerve fibres in the infla med human oesophagus［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol.2004，16（9）：897-902.

［3］李黎，朱生樑.疏肝和胃方治療58例胃食管反流病相關性胸痛臨床觀察［J］．遼寧中醫雜志，2009，36（2）：220-222.

［4］Melih T，Firuzan Y，Tijen U，et al.Esophagitis impairs esophageal smooth muscle reactivity in the rat model：An in vitro study［J］.Dig Dis Sci，2003，48（11）：2147-2152.

［5］袁紅霞，于強，崔乃強.旋復代赭湯對酸性反流性食管炎模型大鼠食管黏膜通透性的影響［J］.北京中醫藥大學學報，2003，26（5）：56-59.

［6］Caterina MJ，Julius D.The vanilloid receptor A molecular gateway to the pain path way［J］.Annu Rev Neurosci，2001， 24：487-517.

［7］Tominaga M，Caterina MJ，Malmberg AB，et a1.the cloned capsaicin receptor integra tes.multiple pain -producing stimul［J］.Neuron，1998，21（3）：531-643.

［8］Hiroto Miwa，Takashi Kondo，Tadayuki Oshima，et al.Esophageal Sensation and Esophageal Hypersensitivity -Overview From Bench to Bedside［J］.J Neurogastroent Erol Motil，2010，16（4）：353-362.

［9］Ma J，Altomare A，Guarino M，et a1.HCl-induced and ATP-dependent upregulation of TRPV1 receptor expression and cytokine production by human esophageal epitheli al cells［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012，303（5）：635-645.

［10］程艷梅，朱生樑，馬淑穎，等.通降和胃方對大鼠混合反流性食管炎食管上皮的影響［J］.山西中醫，2005，21（1）：46-48.

Influence of Shugan Hewei Decoction onTRPV1 in Dorsal Root Ganglia of Rats with Reflux Esophagitis

CAO Huijie，LIU Chunfang，CHENG Yanmei，et al.Putuo Central Hospital Affiliated to Shanghai Medicine University，Shanghai 200002，China.

【Abstract】Objective：To observe the influence of Shugan Hewei Decoction on TRPV1 in dorsal root ganglia of rats with reflux esophagitis and explore the mechanism of the treatment of gastroesophageal reflux disease.Methods：Fourty healthy male Spregue-Dawley（SD）rats were randomly divided into 4 groups（n = 10）：the normal group，the model group，TCM group，Western medicine group.Reflux esophagitis models were induced by cardiomyotomy and pylorus semiligation，and given the corresponding intervention measures.Expression of TRPV1 receptors and the expression of TRPV1mRNA in dorsal root ganglia of rats were observed with immunohistochemical method and QPCR.Results：Compared with the normal group，positive expressions of TRPV1 in model group and Western medicine group were significantly higher（P＜0.05）.There was no significant difference between the treatment group and TCM group（P＞0.05）.Compared with Western medicine group，the positive expression of TRPV1 was significantly decreased in TCM group；the difference was statistically significant（P＜0.05）.The expression level of TRPV1mRNA in model group was significantly higher than normal group，TCM group and Western medicine group（P＜0.05）.The difference was not statistically significant between normal group，TCM group and Western medicine group（P＞0.05）.The expression of TRPV1mRNA in the last two groups was not statistically significant（P＞0.05）.Conclusion：The mechanism of Shugan Hewei Decoction on gastroe sophageal reflux disease may inhibitting the overexpression of TRPV1.

【Key words】Gastroesophageal reflux disease；Reflux esophagitis；Transient receptor potential cation channel 1；Shugan Hewei Decoction

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1004-745X（2016）04-0623-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.017

*基金項目：國家中醫藥管理局“十二五”重點專科項目（No.09JIX1L206B118）；上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院科研基金項目（No.30304115238）

通信作者△（電子郵箱：lef2_hb@163.com）

收稿日期（2015-12-02）