高谷物日糧對山羊小腸發酵、腸道結構和微生物菌群數量的影響研究

薛春旭，葉慧敏，馮泮飛，劉軍花，毛勝勇（南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095）

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高谷物日糧對山羊小腸發酵、腸道結構和微生物菌群數量的影響研究

薛春旭，葉慧敏，馮泮飛，劉軍花，毛勝勇*
（南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210095）

本試驗旨在研究高谷物日糧對山羊小腸微生物發酵、上皮組織形態及微生物菌群數量的影響。采用隨機區組實驗設計，將12頭山羊隨機分為兩組，即全干草組（只飼喂粗飼料）和高谷物組（75%精料和25%粗飼料混合飼喂），每組6頭，試驗期為6周，試驗結束后屠宰取小腸內容物及組織樣品用于相關分析。結果表明，1）與干草組相比，飼喂高谷物日糧顯著提高了空腸內容物中總揮發性脂肪酸（P＝0.015）、丙酸（P＝0.008）、丁酸（P＝0.004）、異丁酸濃度（P＝0.035），降低了乳酸濃度（P＝0.008），但對p H值、乙酸、戊酸、異戊酸濃度及L PS含量無顯著性影響（P＞0.05）。與干草組相比，飼喂高谷物日糧顯著提高了回腸內容物的總揮發性脂肪酸（P＝0.007）、丙酸（P＝0.013）、丁酸（P＝0.008）、戊酸（P＜0.001）、乳酸濃度（P＝0.008）以及脂多糖含量（P＜0.001），降低了p H值（P＝0.005），但對乙酸、異丁酸和異戊酸濃度無顯著影響（P＞0.05）；2）與干草組相比，高谷物日糧組山羊的十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度和隱窩深度均顯著升高（P＜0.001）；空腸絨毛高度與隱窩深度的比值顯著降低（P＝0.024）；電鏡結果表明，高谷物組空腸和回腸緊密連接受到破壞；3）與干草組相比，高谷物日糧組山羊回腸黏膜中堿性磷酸酶活性顯著提高（P＜0.05），但對空腸黏膜中堿性磷酸酶活性無顯著影響（P＞0.05）；4）Real-tim e PC R定量分析表明，與干草對照組相比，高谷物日糧山羊回腸擬桿菌門16S rR N A基因拷貝數顯著降低（P＝0.037），厚壁菌門與擬桿菌門細菌數量比值顯著升高（P＜0.001），但對厚壁菌門細菌基因拷貝數無顯著影響（P＞0.05）；空腸中擬桿菌門基因拷貝數、厚壁菌門基因拷貝數以及厚壁菌門與擬桿菌門細菌數量比值無顯著變化（P＞0.05）。結果說明，飼喂高谷物日糧對回腸上皮組織形態及回腸微生物發酵具有顯著影響，對其健康可能有不利影響。

高谷物日糧；小腸；緊密連接；堿性磷酸酶；微生物

http://cyxb.lzu.edu.cn

薛春旭，葉慧敏，馮泮飛，劉軍花，毛勝勇.高谷物日糧對山羊小腸發酵、腸道結構和微生物菌群數量的影響研究.草業學報，2016，25（5）：175-183.X U E Chun-Xu，Y E H ui-Min，F E N G Pan-Fei，LIU Jun-H ua，M A O Sheng-Yong.T he effect of high-grain diets on sm all intestinal ferm entation，m orphological structure and microbial flora in goats.Acta Prataculturae Sinica，2016，25（5）：175-183.

在現代規模化、集約化牛羊養殖過程中，生產者為追求最大程度經濟效益，常在動物飼料中使用高比例谷物原料，但大量使用高谷物日糧在提高動物生產性能的同時，也引發了一些營養代謝疾病如瘤胃酸中毒。近年來，研究者已對瘤胃酸中毒的致病機制和潛在危害做了大量研究。相關報道顯示，瘤胃酸中毒可改變瘤胃微生物菌群結構與組成［1］，致瘤胃p H值下降、揮發性脂肪酸（volatile fatty acid，V F A）累積，瘤胃內脂多糖（lipopolysaccharide，L PS）和生物胺的濃度顯著增加［2-3］，致瘤胃上皮屏障損傷；同時大量可發酵碳水化合物進入后腸，還可引發后腸酸中毒［4］。因此，這些結果暗示，長期飼喂高谷物日糧可使反芻動物瘤胃與后腸健康受損。

小腸是動物消化道重要的生理器官，其功能包括兩方面：一是接收來自胃初步消化的營養物質，起到容器作用；二是將初步消化的營養物質進一步消化分解成小分子物質，通過腸黏膜上皮細胞吸收進入血液和淋巴。因此，維持小腸的正常結構與功能對于動物健康至關重要。我們前期研究發現，飼喂高谷物日糧除影響山羊瘤胃功能外，瘤胃中未經消化的過量精料進入小腸后，也可能對小腸的生理結構與小腸微生物發酵造成不利影響。然而，當前該領域的研究工作主要集中于飼喂高谷物日糧對山羊前胃與后腸發酵及其上皮健康的影響，有關高谷物日糧對山羊小腸消化生理的影響尚不清楚。因此，本研究以山羊為研究對象，探究了高谷物日糧對山羊小腸上皮形態學變化、堿性磷酸酶活性及微生物菌群的影響，擬進一步豐富人們對高谷物日糧影響動物健康的理論認識。

1 材料與方法

實驗于2014年12月到2015年3月在南京農業大學動物實驗基地進行。

1.1 試驗設計

試驗選用12頭體重相近、安裝有永久性瘤胃瘺管的健康南京本地山羊［（28.4±3.0）kg］，單欄飼養，自由飲水。采用隨機區組試驗設計，將12只山羊分為兩組，即飼喂全干草組（100%粗飼料）以及高谷物組（75%高精料+ 25%的粗飼料），每組6頭，試驗期為6周。飼糧供給量按體重的3.5%計算，預設為1.05 kg，精料和粗飼料分開飼喂，每天飼喂兩次（分別為8：00和17：00），每次等量飼喂。干草與高谷物組的飼料原料組成以及營養水平見表1。

表1 日糧組成與營養水平（D M基礎）Table 1 Ingredients and nutrient composition of the experimental diets（D M basis）

1.2 樣品采集

在實驗期第42天，晨飼前屠宰取十二指腸、空腸和回腸黏膜樣，用冰磷酸緩沖液清洗干凈后，分成3部分，其中一部分立即凍存于液氮中，用于堿性磷酸酶活性測定；另一部分用2.5%戊二醛固定，用于掃描和透射電鏡觀察；其他部分用4%多聚甲醛固定，用于石蠟切片。屠宰后立即取空腸和回腸內容物，各部分分別混合均勻后，分別測定內容物p H值，另取部分按1∶1的重量比與去離子水混合，5000 r/min下離心15 min后，取上清液凍存于－20℃冰箱中用于揮發性脂肪酸、乳酸和L PS濃度的測定，L PS在分析之前使用Li等［5］的方法處理，取10 g樣品轉移到無熱源的管中，其中包含10 m L的生理鹽水，并且混合均勻，4℃、13000 r/min下離心40 min后，收集大約2 m L樣品，過濾到無熱源的玻璃管中，然后100℃加熱30 min。室溫冷卻10 min，存放在－20℃下待測；同時取部分內容物凍存于－20℃冰箱中用于細菌D N A提取。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 空腸、回腸發酵參數的測定 采用比色法測定空腸、回腸內容物中乳酸濃度［6］，采用氣相色譜法（日本，G C-14B氣相色譜儀，色譜柱型號為A gilent J & W G C Colu m ns：30 m×0.32 m m×0.25μm，柱溫110℃，氣化室溫度180℃，檢測室溫度180℃）測定揮發性脂肪酸濃度［7］。p H值用p H計（HI 9024 C，H A N N A）測定。采用顯色基質特異性鱟試劑盒測定游離L PS濃度（廈門鱟試劑廠有限公司），基本原理是內毒素可激活鱟試劑中的C因子，進而激活凝固酶原，凝固酶可水解人工合成顯色基質鱟三肽釋放出呈黃色的對硝基苯胺（para nitro aniline，P N A），再將P N A重氮化形成偶氮蘭復合物（呈玫瑰紅），該復合物可于545 n m波長處測定吸光度。試劑盒包括：鱟試劑（1.7 m L/支）、顯色基質（1.7 m L/支）、細菌內毒素工作品（9 E U/支）、偶氮化試劑1（10 m L/支）、偶氮化試劑2（10 m L/支）、偶氮化試劑3（10 m L/支）、細菌內毒素檢查用水（50 m L/瓶）、反應終止液（鹽酸H Cl，50 m L/瓶）。

1.3.2 空腸和回腸黏膜堿性磷酸酶活性的測定

山羊空腸和回腸黏膜的堿性磷酸酶活性的測定采用試劑盒。試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3.3 組織切片的處理 用4%多聚甲醛固定，洗滌、酒精梯度脫水、浸蠟、包埋、切片、帖片、脫蠟復水、蘇木精－伊紅染色、封固，在光學顯微鏡下觀察十二指腸、空腸和回腸上皮組織形態的變化。

1.3.4 電鏡樣品的處理 用冰磷酸緩沖液反復清洗各腸組織樣品，2.5%的戊二醛固定后，磷酸緩沖液清洗；采用乙醇脫水后，冷凍干燥儀干燥樣品，用離子濺射儀鍍膜，掃描電子顯微鏡進行觀察（S-3000 N，日本，HIT AC HI）。透射電鏡實驗中的樣品前處理與掃描電鏡預處理一致，綴以1%的鋨酸固定，乙醇梯度脫水，用丙酮置換后，浸漬、包埋、聚合，修塊使樣品表面積小于0.2 m m×0.2 m m，超薄切片，經鈾染色與鉛染色清洗后，透射電子顯微鏡（H-7650，日本，HIT A C HI）進行觀察。

1.3.5 總細菌D N A提取和16S rR N A基因片段擴增 稱取約0.1 g解凍后的腸道內容物樣至滅菌后的Eppendorf管中，加入1.5 m L的磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（p H＝7.0），渦旋混合，13000 r/min離心5 min，棄上清，參照K hafipour等［1］的方法，用珠磨法機械破碎樣品，后用酚和氯仿/異戊醇提取其總D N A。提取D N A于－20℃保存備用。

1.3.6 Real-tim e P C R定量分析 使用A BI 7500 Real-tim e P C R儀（A pplied Biosysterm）對腸道內容物樣中擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）進行定量。分別以化膿擬桿菌（Bacteroides pyogenus）和厚壁菌的16S rR N A基因作為模板，模板拷貝數分別為3.29×109和7.48×109copies/μL。模板按照10倍梯度向下稀釋，在標準曲線上使用5個點，每個點3次重復檢測，制作相應細菌定量的標準曲線。Real-tim e P C R反應體系為20μL：10.4μL S Y B R Green Supermix（T O Y O B O），10μm ol/L的上下游引物各0.4μL，2μL樣品D N A以及6.8μL無菌水。實驗定量P C R分析所用引物見表2，引物Bact934F/Bact1060 R和Firm 934F/Firm 1060 R［8］分別用于定量山羊腸道內容物樣中擬桿菌門和厚壁菌門的16S rR N A基因拷貝數，P C R反應程序為：95℃10 min，而后95℃30 s，60℃下退火及延伸1 min，40個循環。

表2 本研究中所用引物序列Table 2 List of primers used in this study

1.4 數據處理

試驗數據采用SPPS（SPSS version 18.0，Chicago，IL）統計軟件中Independent T-test程序進行統計分析。試驗結果均以平均值±標準誤表示。顯著性置于0.05水平。

2 結果與分析

2.1 山羊空腸和回腸發酵參數

由表3可見，與干草組相比，飼喂高谷物日糧顯著提高了空腸總揮發性脂肪酸（P＝0.015）、丙酸（P＝0.008）、丁酸（P＝0.004）、異丁酸濃度（P＝0.035），降低了乳酸濃度（P＝0.008），但對空腸內容物中p H、乙酸、戊酸、異戊酸濃度及L PS含量無顯著性影響（P＞0.05）。與干草組相比，飼喂高谷物日糧顯著提高了回腸總揮發性脂肪酸（P＝0.007）、丙酸（P＝0.013）、丁酸（P＝0.008）、戊酸（P＜0.001）、乳酸濃度（P＝0.008）以及L PS含量（P＜0.001），降低了回腸內容物的p H值（P＝0.005），但對乙酸、異丁酸和異戊酸濃度無顯著影響（P＞0.05）。

2.2 山羊小腸上皮形態結構

由圖1可見，光學顯微鏡下觀測結果表明，與干草組相比（十二指腸：圖1 A；空腸：圖1 C），高谷物日糧組十二指腸（圖1B）和空腸（圖1 D）的細胞間空隙明顯增大。與干草組（圖1 E和圖1 G）相比，高谷物日糧組的回腸（圖1F和圖1 H）絨毛松散，出現脫落現象，排列不齊。透射電鏡結果表明，與干草組（空腸：圖1I；回腸：圖1 K）相比，高谷物日糧組的空腸（圖1J）緊密連接縫隙變大、回腸（圖1 L）緊密連接結構模糊不清。

表3 高谷物日糧對山羊空腸和回腸發酵參數的影響Table 3 Effects of a high grain diet feeding on the jejunal and ileal fermentation parameters in goats

圖1 飼喂高谷物日糧對山羊十二指腸、空腸與回腸上皮形態的影響Fig.1 The effect of a high grain diet feeding on changes in histomorphology of duodenu m，jejunu m and ileu m epitheliu m

2.3 山羊小腸絨毛高度和隱窩深度

從表4可知，高谷物組山羊十二指腸、空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度極顯著高于干草對照組（P＜0.001）。與干草對照組相比，高谷物組山羊空腸絨毛高度與隱窩深度的比值顯著下降（P＝0.024）。而十二指腸、回腸的絨毛高度與隱窩深度的比值差異不顯著（P＞0.05）。

表4 高谷物日糧對山羊小腸絨毛高度和隱窩深度的影響Table 4 Effect of a high grain diet on the smallintestinal villi height and crypt depth in goats

2.4 空腸和回腸內容物中厚壁菌門與擬桿菌門數量

由表5可見，與干草組相比，高谷物日糧組山羊回腸擬桿菌門16S rR N A基因的拷貝數顯著降低（P＝0.037），同時厚壁菌門與擬桿菌門細菌數量比值顯著升高（P＜0.001），但兩組間厚壁菌門細菌數量無顯著差異（P＞0.05）；與對照組相比，飼喂高谷物日糧對空腸中擬桿菌門、厚壁菌門16S rR N A基因的拷貝數及二者間的比例無顯著影響（P＞0.05）。

表5 高谷物日糧對空腸、回腸內容物中擬桿菌門和厚壁菌門16S rR N A基因拷貝數的影響Table 5 Effect of a high grain diet on the 16S rR N A gene copy nu m ber of Firmicutes and Bacteroidetes in jejunu m and ileu m digesta

2.5 山羊空腸和回腸堿性磷酸酶活性

由表6可見，與干草對照組相比，飼喂高谷物日糧可以提高回腸黏膜中堿性磷酸酶活性（P＝0.046），但對山羊空腸中堿性磷酸酶活性無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論與結論

表6 高谷物日糧對山羊空腸和回腸中堿性磷酸酶的影響Table 6 Effect of a high grain diet on the activity of alkaline phosphatase in jejunu m and ileu m m ucosa

小腸作為消化道內營養物質吸收和轉運的主要部位，其絨毛高度及隱窩深度是衡量腸道消化吸收功能的重要指標［9-10］。研究顯示，小腸絨毛高度下降說明其吸收功能可能下降；而隱窩深度變淺則顯示細胞成熟率上升，分泌功能增強［11］。本試驗結果顯示，飼喂高谷物日糧的山羊十二指腸、空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度極顯著高于對照組（P＜0.001），結果說明飼喂高谷物日糧可促進小腸黏膜生長，增強消化吸收功能，其原因可能與空腸（P＝0.004）和回腸（P＝0.008）中丁酸含量顯著升高有關。相關研究表明，腸道丁酸濃度升高可下調消化道上皮中胰島素結合蛋白3（IG FBP-3）基因表達，由于IG FBP-3是胰島素樣生長因子1（IG F-1）的重要結合蛋白，其表達水平下降可導致IG F-1的釋放量增加，而IG F-1增加可促進腸上皮細胞的生長［12］。此外，也有研究表明，丁酸可通過減少消化道上皮細胞的凋亡來誘導上皮乳頭狀突起的生長［13］。因此，丁酸可能通過多條途徑影響腸上皮生長。

研究顯示，飼喂高谷物日糧可提高奶牛與山羊后腸中總揮發性脂肪酸濃度［5］，致p H值下降。本實驗發現，飼喂高谷物日糧的山羊空腸和回腸內容物中總揮發性脂肪酸濃度升高，結果與上述報道相似，說明飼喂高谷物日糧同時也影響了山羊小腸微生物發酵。本實驗同時發現，高谷物組山羊的回腸乳酸濃度顯著升高，說明高谷物日糧可能有利于回腸中乳酸菌生長。研究表明，飼喂大量谷物可提高奶牛瘤胃液中游離脂多糖的濃度，而低p H與高濃度L PS可能損傷瘤胃上皮結構［14］。本實驗中飼喂高谷物日糧山羊的回腸內容中L PS濃度顯著升高，結果與上述報道相似。說明飼喂高谷物日糧不僅可影響瘤胃與后腸發酵，同時影響小腸尤其是回腸微生物發酵。

對反芻動物而言，較瘤胃復層上皮相比，由單層上皮細胞組成的小腸上皮屏障完整性更易被破壞［15］。在腸上皮屏障中，細胞間緊密連接在維護上皮屏障功能、上皮細胞極性及上皮屏障通透性中起到重要作用［16-17］。研究顯示，飼喂高谷物日糧可破壞奶牛結腸黏膜屏障的完整性和通透性，導致腸上皮屏障損傷，在形態學上表現為腸上皮緊密連接間隙變寬，上皮細胞核破裂和線粒體結構性損傷［18］，線粒體結構性損傷可進一步抑制A T P的生成［19-20］，進而影響與上皮通透性相關的緊密連接蛋白Claudin-4和Occludin的基因轉錄與翻譯，最終導致這些蛋白的表達下降，上皮通透性發生改變，引發細胞腫脹壞死和大分子物質（微生物和微生物產物，如L PS）易位，造成腸道損傷［14］。本實驗中，光學顯微鏡觀測結果表明，與對照組相比，飼喂高谷物日糧的山羊回腸絨毛松散，出現脫落現象，排列不齊。透射電鏡結果表明，回腸緊密連接結構模糊不清。我們推測，出現上述結果的原因可能與高谷物日糧下山羊回腸中p H值顯著降低所引發的系列生理效應有關。此外，本試驗結果發現，飼喂高谷物日糧組的山羊的空腸空隙明顯增大，緊密連接出現開口，空腸絨毛高度與隱窩深度的比值顯著下降。前人研究表明，腸絨毛高度與隱窩深度的比值可反應小腸黏膜的受損程度，比值下降暗示小腸黏膜受損［21］。因此，上述結果說明，飼喂高谷物組山羊的空腸黏膜也受到損傷，但本實驗結果未發現高谷物組與干草組山羊的空腸p H值及L PS濃度有顯著差異，因此，空腸上皮出現明顯損傷的原因尚不清楚，需進一步研究。

日糧是影響腸道微生物區系結構和功能的主要因素之一［22-24］。研究表明，日糧原料特性及其物理性質改變可導致奶牛瘤胃與后腸發酵模式變化，進而引發瘤胃與后腸微生物菌群結構發生改變。相關研究顯示，當奶牛日糧從以粗飼料為主的日糧轉變為高谷物日糧為主時，瘤胃中總揮發性脂肪酸濃度顯著升高，同時瘤胃菌群中擬桿菌門比例會顯著下降，而厚壁菌門比例顯著升高［25］。本研究發現，飼喂高谷物日糧顯著提高了空腸與回腸內容物中總揮發性脂肪酸含量，顯著影響了回腸中擬桿菌門數量，但對山羊空腸中厚壁菌門與擬桿菌門細菌的數量無顯著影響；我們推測，高谷物日糧對兩段腸道內容物中微生物菌群數量影響不一致的原因可能與食糜流通速度不同有關。較空腸相比，回腸中食糜的流通速度較低；因此，回腸內容物中微生物可充分利用底物生長，因而數量較高；這也說明日糧可能更易影響微生物菌群結構與組成。本試驗同時發現，飼喂高谷物日糧顯著降低了擬桿菌門細菌數量，由于擬桿菌門細菌主要為革蘭氏陰性菌，而革蘭氏陰性菌對環境p H值尤其敏感，因此，其數量下降可能與回腸內容物p H值下降有關；同時，革蘭氏陰性菌細胞壁中含有大量的脂多糖，因此，該類微生物可能因不適應低p H而導致細菌大量死亡、裂解，最終導致內容物中L PS濃度顯著升高［26］。

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）是一種非特異性磷酸單脂酶，廣泛存在于動物界和微生物界，可催化磷酸單脂水解反應和轉磷酸作用。研究表明，堿性磷酸酶在腸道免疫中發揮作用，其主要存在于腸上皮表面，可作為腸道黏膜防護因子［27］，是防止脂多糖進入機體的第一道防線。近年來研究發現，小牛腸堿性磷酸酶可作為一種新型藥物制劑，治療小鼠和仔豬因L PS誘發的腸源性疾病［28］，其原理與堿性磷酸酶可通過對L PS的脫磷酸反應，進而減弱革蘭陰性菌毒性有關［29-31］。本研究中，高谷物日糧顯著提高了回腸黏膜中堿性磷酸酶活性（P＜0.05），但對山羊空腸黏膜的堿性磷酸酶活性無顯著影響。其原因可能與飼喂高谷物日糧組山羊空腸內容物中L PS濃度顯著升高有關。實際上，在L PS濃度升高情況下，動物機體可能會對L PS產生一種生理性應答，以阻止L PS對上皮組織的損傷。該結果同時表明，堿性磷酸酶可能在調控L PS的生理毒性和維護動物腸上皮屏障功能中起著重要作用。

綜上所述，飼喂高谷物日糧可提高山羊空腸與回腸中總揮發性脂肪酸濃度，致回腸內容物p H下降、乳酸及L PS濃度升高；同時回腸上皮緊密連接受損，回腸擬桿菌門數量與堿性磷酸酶活性受到影響。結果暗示，飼喂高谷物日糧改變了小腸微生物發酵，導致小腸上皮健康受損。

References：

［1］K hafipour E，Li S，Plaizier J C，etal.Ru m en microbio m e co m position determined using two nutritional m odels of subacute ru minal acidosis.A pplied and Environ m ental Microbiology，2009，22：7115-7124.

［2］K hafipour E，Krause D O，Plaizier J C.A grain-based subacute ru minal acidosis challenge causes translocation of lipopolysaccharide and triggers infla m m ation.Journal of Dairy Science，2009，92：1060-1070.

［3］W ang D S，Zhang R Y，Zhu W Y，etal.Effects of subacute ru minal acidosis challenges on ferm entation and biogenic a mines in the ru m en of dairy cows.Livestock Science，2013，155：262-272.

［4］Gressley T F，H all M B，Arm entano L E.Ru minant nutrition sy m posiu m：productivity，digestion，and health responses to hindgut acidosis in ru minants.Journal of A nim al Science，2011，89（4）：1120-1130.

［5］Li S，K hafipour E，Krause D O，etal.Effects of subacute ru minal acidosis challenges on ferm entation and endotoxins in the ru m en and hindgut of dairy cows.Journal of Dairy Science，2012，95（1）：294-303.

［6］Zhang L X，Zhang T F，Li L Y.Bioche mical Test M ethod and Technology（second edition）［M］.Beijing：Higher Education Press，1997.

［7］Qin W L.Determination of volatile fatty acids by m eans of gas chro m atography.Journal of Nanjing A gricultural U niversity，1982，5：110-116.

［8］Guo X，Xia X，Tang R，etal.Develop m ent of a real-tim e PC R m ethod for Firmicutes and Bacteroidetesin faeces and its application to quantify intestinal population of obese and lean pigs.Letters in A pplied Microbiology，2008，47：367-373.

［9］Li D F.S wine N utrition（second edition）［M］.Beijing：China’s A gricultural Science and Technology Press，2003：7-10.

［10］Li K Z，Li N，Li J S，etal.The effect of short-chain fatty acids（SFC A）on intestinal m orphology and kinetic energy after rat s m all bowel transplantation.W orld Chinese Journal of Digestology，2002，10（6）：720-722.

［11］Eid Y Z，O htsuka A，H ayashi K.Tea polychenols reduce glucocorticoid-induced growth inhibition and oxidative stress in broiler chickens.British Poultry Science，2003，44：127-132.

［12］Van landeqhe m L，Santoro M A，M ah A T，etal.IG F1 stim ulates crypt expansion via differential activation of 2 intestinal ste m cell populations.The Journal of the Federation of A m erican Societies for Experim ental Biology，2015，29（7）：2828-2842.

［13］M entschel J，Leiser R，M ulling C，etal.Butyric acid stim ulates ru m en m ucosa develop m entin the calf m ainly by a reduction of apoptosis.Archives of A nim al N utrition，2001，55：85-102.

［14］Liu J H，Xu T T，Zhu W Y，etal.A high-grain diet alters the o m asal epithelial structure and expression of tight junction proteins in goat m odel.The Veterinary Journal，2014，201（1）：95-100.

［15］Oetzel G R.Subacute ru minal acidosis in dairy cattle.A dvances in Dairy Technology，2003，15：307-317.

［16］Graha m C，Sim m ons N L.Functional organization of the bovine ru m en epitheliu m.A m erican Journal of Physiology Regulatory Integrative and Co m parative Physiology，2005，288（1）：173-181.

［17］Penner G B，Steele M A，Aschenbach J R，etal.Ru minant nutrition sy m posiu m：m olecular adaptation of ru minal epithelia to highly ferm entable diets.Journal of A nim al Science，2011，89（4）：1108-1119.

［18］Tao S Y，Duan m u Y Q，Dong H B，etal.A high-concentrate diet induced colonic epithelial barrier disruption is associated with the activating of cell apoptosis in lactating goats.B M C Veterinary Research，2014，10：235.

［19］Gaebel G，Bell M，M artens H.The effect of low m ucosal p H on sodiu m and chloride m ove m ent across the isolated ru m en m ucosa of sheep.Q uarterly Journal of Experim ental Physiology and Cognate M edical Sciences，1989，74：35-44.

［20］Teixeira B M，Kowaltowski A J，Castilho R F，etal.Inhibition of mitochondrial perm eability transition by low p H is associated with less extensive m e m brane protein thiol oxidation.Bioscience Reports，1999，19：525-533.

［21］Xie D，Chen Y X，W ang Z X，etal.Effects of m onochro m atic light on structure of s m allintestinal m ucosa in broilers.Scien-tia A gricultura Sinica，2009，42（3）：1084-1090.

［22］Kocherginskaya S A，A minov R I，W hite B A，etal.A nalysis of the ru m en bacterial diversity under two different diet conditions using denaturing gradient gel electrophoresis，rando m sequencing，and statistical ecology approaches.A naerobe，2001，7：119-134.

［23］Tajim a K，Arai S，O gata K，etal.Ru m en bacterial co m m unity transition during adaptation to high-grain diet.A naerobe，2000，6：273-284.

［24］Zhou M，H ernandez-Sanabria E，Guan L L.Characterization of variation in ru m en m ethanogenic co m m unities under different dietary and host feed efficiency conditions，as determined by PC R-denaturing gradient gel electrophoresis analysis.A pplied and Environ m ental Microbiology，2010，76：3776-3786.

［25］Fernando S C，Purvis H T，Najar F Z，etal.Ru m en microbial population dyna mics during adaptation to a high-grain diet.A pplied and Environ m ental Microbiology，2010，76（22）：7482-8490.

［26］H uo W J，Zhu W Y，M ao S Y.Effects of feeding increasing proportions of corn grain on concentration of lipopolysaccharide in the ru m en fluid and the subsequent alterations in im m une responses in goats.Asian-A ustralasian Journal of A nim al Science，2013，26（10）：1437-1445.

［27］Chen K T，M alo M S，Beasley-Topliffe L K，etal.A role for intestinal alkaline phosphatase in the m aintenance of local gut im m unity.Digestive Diseases and Sciences，2011，56（4）：1020-1027.

［28］Tian X J，Song X H，Yan S J，etal.Study of refolding of calf intestinal alkaline phosphatase.Protein Che mistry，2003，22（5）：417-422.

［29］Goldberg R F，A usten W G Jr，Zhang X，etal.Intestinal alkaline phosphatase is a gut m ucosal defense factor m aintained by enteral nutrition.Proceedings of the National Acade m y of Sciences of the U nited States of A m erica，2008，105（9）：3551-3556.

［30］Bates J M，A kerlund J，Mittge E，etal.Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents infla m m ation in zebrafish in response to the gut microbiota.Cell H ost Microbe，2007，2（6）：371-382.

［31］Poelstra K，Bakker W W，Klok P A，etal.Dephosphorylation of endotoxin by alkaline phosphataseinvivo.A m erican Journal of Pathology，1997，151（4）：1163-1169.

［6］張龍翔，張庭芳，李玲媛.生化試驗方法和技術第二版［M］.北京：高等教育出版社，1997.

［7］秦為琳.應用氣相色譜測定揮發性脂肪酸方法的研究改進.南京農業大學學報，1982，5：110-116.

［9］李德發.豬的營養（第二版）［M］.北京：中國農業科學技術出版社，2003：7-10.

［10］李可洲，李寧，黎介壽，等.短鏈脂肪酸對大鼠移植小腸形態及動能的作用研究.世界華人消化雜志，2002，10（6）：720-722.

［21］謝電，陳耀星，王子旭，等.單色光對肉雛雞小腸黏膜形態結構的影響.中國農業科學，2009，42（3）：1084-1090.

The effect of high-grain diets on small intestinal fermentation，morphological structure and microbial flora in goats

X U E Chun-Xu，Y E H ui-Min，F E N G Pan-Fei，LIU Jun-H ua，M A O Sheng-Y ong*

Collegeof Animal Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China

T his study investigated the effect of high-grain（H G）diets on microbial ferm entation，epithelial tissue m orphology，alkaline phosphatase activity and the quantity of microbial flora in the s m all intestine of goats.T welve goats were rando mly allocated to tw o groups（6 in each group）and were fed a hay（0%grain）or H G diet（75%grain）for 6 weeks.After 6 weeks offeeding，the goats were slaughtered to collect s m allintestinal digesta and tissue for analysis.T he results showed that：1）Co m pared with the hay group，H G feeding sig-nificantly increased the concentrations of total volatile fatty acid（P＝0.015），propionate（P＝0.008），butyrate （P＝0.004）and isobutyrate（P＝0.035），w hile it significantly decreased the concentration of lactic acid（P＝0.008）.H owever，H G diet feeding did not influence p H or the concentrations of acetate，valerate，isovalerate and L PS in jejuna digesta（P＞0.05）；Co m pared with the hay group，H G diet increased the concentrations of total volatile fatty acid（P＝0.007），propionate（P＝0.013），butyrate（P＝0.008），valerate（P＜0.001），lactic acid（P＝0.008）and lipopolysaccharide levels（P＜0.001），w hile it decreased the p H value（P＝0.005）in ileal digesta.T here were no significant differences in the concentrations of acetate，isobutyrate，isovalerate between the hay and H G groups（P＞0.05）.2）Co m pared with the control，H G feeding significantly increased villi height and crypt depth in the duodenu m，jejunu m and ileu m tissue（P＜0.001）.T he ratio of villus height to crypt depth（V/C）increased in the jejunu m（P＝0.024）.Trans mission electron micrographs ofjejunu m and ileu m tissue during the H G diet displayed a deterioration of the tight junction.3）Co m pared with the control，H G diets significantly increased the alkaline phosphatase activity of ileal m ucosa（P＜0.05），but had no influence on the alkaline phosphatase activity of jejunu m m ucosa（P＞0.05）.4）Real-tim e P C R analysis showed that in ileu m digesta the 16S rR N A gene copies of Bacteroidetes fro m the H G group were significantly lower than for the hay group（P＝0.037）.T he H G group showed an increase in the ratio of Firmicutesto Bacteroidetes（P＜0.001），w hile there was no significant difference in the 16S rR N A gene copies of Firmicutes（P＞0.05）.N o significant differences（P＞0.05）between the hay and H G groups’jejunu m digesta were observed in the 16S rR N A gene copies of Bacteroidetes and Firmicutes，or in the ratio of Firmicutes to Bacteroidetes.In su m m ary，these resultsindicate that feeding goats high proportions of grain can significantly influence the m orphological characteristics ofileal epitheliu m and microbialferm entation in ileal digesta，and m ay have a negative effect on the health of goats.

high-grain diet；s m allintestine；tight junction；alkaline phosphatase；microbial flora

.E-m ail：m aoshengyong＠163.com

10.11686/cyxb2015381

2015-08-31；改回日期：2015-11-03

國家自然科學基金項目（31372339）資助。

薛春旭（1991-），女，天津人，在讀碩士。E-m ail：xuechunxu2014＠163.com