紫檀茋和乙酰紫草素抑制B16F10細胞增殖的協同作用

陳　虹，張閃閃，董錦蕾，鐘　晶，王曉琴，張　波

(石河子大學 1.藥學院，2.省部共建新疆特種資源植物藥重點實驗室，新疆 石河子　832002)

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紫檀茋和乙酰紫草素抑制B16F10細胞增殖的協同作用

陳虹1,2，張閃閃1,2，董錦蕾1,2，鐘晶1,2，王曉琴1，張波1,2

(石河子大學 1.藥學院，2.省部共建新疆特種資源植物藥重點實驗室，新疆 石河子832002)

摘要：目的研究紫檀茋和乙酰紫草素對B16F10細胞的增殖抑制的協同作用與相關機制。方法通過系統藥理學的方法對紫檀茋和乙酰紫草素的聯合作用進行預測，并對可能靶點進行篩選及分析。體外采用MTT法測定紫檀茋、乙酰紫草素及聯合用藥對B16F10細胞的抑制效應；形態學水平觀察細胞核的凋亡情況；流式細胞技術檢測細胞凋亡及周期的變化；RT-PCR法檢測細胞內相關基因的表達；體內實驗采用C57BL/6小鼠移植瘤方法。結果紫檀茋有14個靶點與周期相關，乙酰紫草素有12個靶點與凋亡相關，且均有靶點與p53信號通路相關。紫檀茋、乙酰紫草素及聯合用藥對B16F10細胞的增殖均有抑制作用，并呈濃度劑量依賴性，并具有顯著協同效果；聯合給藥組細胞凋亡率最高，且周期阻滯在G1期；單一給藥組的p53、Bax及p21基因的表達隨給藥時間的延長而增加，而Bcl-2、CDK2、Cyclin E基因的表達隨給藥時間而減少，聯合給藥組p53，Bax和Bcl-2的變化差異較單獨給藥組顯著；體內抑瘤實驗給藥組均有不同程度的抑瘤效果，以聯合給藥組抑瘤率最大。結論紫檀茋和乙酰紫草素對B16F10細胞的增殖有一定協同抑制作用，認為二者協同激活p53信號通路，誘導周期阻滯和凋亡而發揮藥效。

關鍵詞：黑色素瘤；紫檀茋；乙酰紫草素；聯合用藥；凋亡；細胞周期；抑瘤率

馬錢子蜈蚣膏方劑的主要活性成分紫檀茋和乙酰紫草素[1]，文獻報道對腫瘤均具有較好的療效[2-3]。紫檀茋是一種低毒的二苯乙烯結構白藜蘆醇衍生物，其具有良好的抗炎、抗氧化等活性[4]。而乙酰紫草素屬于有毒的萘醌類結構，具有抗菌、助氧化等活性，對多種癌癥細胞株的IC50<10 μmol·L-1，并且能引起細胞凋亡，甚至壞死[5-6]。目前僅有文獻報道紫草提取物對B16F10黑色素瘤的抗腫瘤活性[7]。紫檀茋和乙酰紫草素是否存在協同的抗腫瘤藥效，尚不明確。為了闡述馬錢子蜈蚣膏方劑中的兩種活性成分的可能藥理作用，本研究以黑色素瘤體內外實驗為基礎，結合系統藥理分析其相關機制。

Fig 1　Structure of pterostilbene and acetylshikonin

1材料與方法

1.1實驗細胞及動物

小鼠黑色素瘤細胞B16F10，購自中國科學院細胞庫；C57BL/6小鼠購于新疆醫學院。

1.2主要藥物及試劑

乙酰紫草素(ACS，純度98%)及紫檀茋(PTER，純度98%)，上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白酶，美國Sigma公司，批號509D043；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批號20150512；DMEM細胞培養基，Gibco公司，批號1643132；MTT、Hoechst 33258染液為北京索萊寶公司，批號為303H058、20150814；Annexin V/FITC凋亡檢測試劑盒，南京凱基生物科技發展有限公司，批號20150922；PI染料，購于美國Becton dickinson公司，批號2226867；TaKaRa逆轉錄試劑盒，日本TaKaRa公司，批號AK5401；UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒，為上海生工公司產品，批號13909KA1108；引物均購自上海生工。

1.3主要儀器

CO2細胞培養箱(Thermo 3131，Thermo，美國)；超凈工作臺(ZHJH 1112B，智誠分析儀器，上海)；倒置熒光顯微鏡(MIC00266，Zeiss，德國)；倒置生物顯微鏡(BDS200 PH，奧特光學儀器，重慶)；多功能酶標儀(Thermo VarioFlash 3001，Thermo，美國)；低溫離心機(5424，Eppendorf，德國)；流式細胞儀(FACSCalibur，BD，美國)。

2方法

2.1活性化合物的篩選

馬錢子蜈蚣膏方劑由馬錢子、蜈蚣、紫草和血竭各等分組成，且對皮膚癌有一定療效。本研究采用系統藥理學的方法，從TCMSP數據庫和文獻挖掘獲得4味藥中156個活性化合物，依據化合物的脂水分布系數(alogP)和類藥性(DL)等性質，及所含腫瘤相關靶點的數量，與腫瘤疾病的相關性篩選出化合物乙酰紫草素和紫檀茋，采用這兩種化合物的聯合用藥驗證此處方對皮膚癌的療效。同時挖掘出其相關的靶點群，并在后續的實驗中加以驗證[8]。

2.2細胞培養

取生長狀態良好B16F10細胞，用含10%胎牛血清、青霉素(終濃度100 kU·L-1)及鏈霉素(終濃度100 mg·L-1)的DMEM培養液(pH=7.5)，在37℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，取對數生長期細胞進行各項實驗。

2.3細胞抑制率的測定

96孔培養板上，每孔接種5×104個細胞，培養液體積為100 μL，24 h后加入不同濃度的乙酰紫草素(0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μmol·L-1)，紫檀茋(0、15、30、45、60、75、90、105 μmol·L-1)，聯合給藥(乙酰紫草素分別為0、0.25、0.5、1.0、2.0 μmol·L-1，紫檀茋均為20 μmol·L-1)，每組設6個復孔，37 ℃分別培養24 h，每孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h，800×g離心5 min棄上清，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，酶標儀檢測570 nm處的吸光度(OD)值，按下式計算細胞增殖抑制率[9]：

2.4倒置顯微鏡觀察B16F10細胞的形態

取對數生長期B16F10細胞，在超凈工作臺上，用吸管吹打細胞瓶壁，制成細胞懸液，細胞計數并調整細胞懸液的濃度為1×105個，并接種在6孔板上，每孔加2 mL，置于培養箱中培養24 h后給藥，終濃度為0 μmol·L-1，紫檀茋20 μmol·L-1，乙酰紫草素0.5 μmol·L-1，聯合給藥組(紫檀茋20 μmol·L-1和乙酰紫草素0.5 μmol·L-1)，藥物作用24 h后，分別在倒置顯微鏡下拍照觀察其形態的變化[9]。

2.5Hoechst 33258熒光法觀察細胞形態

取對數期細胞，消化制成細胞懸液，按每孔1×105個置于預先置入玻璃蓋玻片的6孔培養板中，每孔加細胞懸液2 mL，24 h后給藥，終濃度為0 μmol·L-1，紫檀茋20 μmol·L-1，乙酰紫草素0.5 μmol·L-1，聯合給藥組(紫檀茋20 μmol·L-1和乙酰紫草素0.5 μmol·L-1)，在孵育24 h后吸盡培養液，PBS洗2遍，每孔加入1 mL固定液(甲醇 ∶冰醋酸=3 ∶1)，固定15 min，去除固定液，用PBS洗2遍，加入10 μg·L-1的Hoechst 33258，染色10 min，用PBS洗2遍，之后將蓋玻片放于載玻片之上，于熒光顯微鏡下觀察細胞內凋亡情況[10]。

2.6流式細胞技術檢測細胞凋亡率

取對數期細胞，消化制成細胞懸液，按2×105個置于細胞培養瓶內，每瓶加細胞懸液2 mL，24 h后給藥，終濃度為0 μmol·L-1，紫檀茋20 μmol·L-1，乙酰紫草素0.5 μmol·L-1，聯合給藥組(紫檀茋20 μmol·L-1和乙酰紫草素0.5 μmol·L-1)，孵育24 h后收集細胞，用冷PBS洗1遍后，置0℃水浴中，加500 μL Binding Buffer懸浮細胞，再加入5 μL Annexin V和5 μL PI，輕輕混勻細胞，10 min后進行流式細胞儀檢測[11]。

2.7流式細胞儀檢測細胞周期

取對數期細胞消化制成細胞懸液，按2×105個置于細胞培養瓶內，每瓶加細胞懸液2 mL，24 h后給藥，終濃度為0 μmol·L-1，紫檀茋20 μmol·L-1，乙酰紫草素0.5 μmol·L-1，聯合給藥組(紫檀茋20 μmol·L-1和乙酰紫草素0.5 μmol·L-1)，孵育24 h后收集細胞，PBS洗2次，體積分數為70%冷乙醇固定過夜。次日離心洗滌后，加入25 mg·L-1的RNase和50 mg·L-1的 PI，避光染色30 min。流式細胞儀檢測細胞周期分布，用Modfit軟件分析數據[10]。

2.8RT-PCR方法來檢測細胞凋亡相關分子

分別按終濃度為紫檀茋20 μmol·L-1，乙酰紫草素0.5 μmol·L-1，聯合給藥組(紫檀茋20 μmol·L-1和乙酰紫草素0.5 μmol·L-1)處理細胞0、6、12、24 h。使用UNIQ 10柱式TRIzol總RNA提取試劑盒提取RNA，并用TaKaRa逆轉錄試劑盒，將RNA逆轉錄為cDNA。PCR擴增條件為：熱啟動，起始溫度94℃，5 min；變性94℃，30 s；退火溫度根據引物而設，30 s；延伸72℃，30 s；重復延伸72℃，5 min；擴增循環數22～28。PCR產物經瓊脂糖凝膠(2%)電泳后，使用核酸染料染色，凝膠成像系統拍照分析[9]。引物序列及退火溫度見Tab 1。

2.9體內實驗

小鼠黑色素瘤B16F10細胞用胰酶消化后收集，將0.2 mL含有2×106個細胞的懸液注射到C57BL/6小鼠右側腋下區域。腫瘤接種24 h后，嚴格按隨機數字表示分成6組[模型組、溶劑對照組，環磷酰胺組20 mg·kg-1、紫檀茋組60 mg·kg-1，乙酰紫草素組6 mg·kg-1，聯合用藥組(紫檀茋60 mg·kg-1和乙酰紫草素6 mg·kg-1)]，紫檀茋和乙酰紫草素用玉米油溶解，每組6只，做黑色素瘤的抑瘤率實驗。環磷酰胺每日腹腔注射給藥，紫檀茋每日灌胃給藥，乙酰紫草素隔日灌胃，給藥10 d后，頸部脫臼處死小鼠，剝離腋下瘤，并稱重拍照。腫瘤抑瘤率/%=[1-(給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重)]×100%[13]。

Tab 1　Primer sequence table[12]

2.10數據分析

3結果

3.1靶點群

紫檀茋的靶點中有14個是與周期相關的(淡紫色)，乙酰紫草素靶點中有12個是與凋亡相關的(粉色)，且紫檀茋和乙酰紫草素分別有6、9個靶點與p53信號通路相關(淡紫色與粉色交集)(Fig 2)。

Fig 2　The network for pterostilbene and acetylshikonin and their candidate targets

3.2聯合用藥對B16F10細胞有明顯的協同作用

紫檀茋對B16F10細胞的24 h半數抑制濃度(IC50) 為78 μmol·L-1，乙酰紫草素對B16F10細胞的24 h半數抑制濃度(IC50) 為2.7 μmol·L-1，紫檀茋和乙酰紫草素對B16F10細胞的抑制作用均隨作用濃度與時間增加而增強，呈現一定的時效與量效關系(Fig 3)。二者聯合用藥的(IC50)為紫檀茋20 μmol·L-1和乙酰紫草素1.1 μmol·L-1，從中可以看出聯合給藥能明顯抑制B16F10細胞的增長。當紫檀茋濃度為20 μmol·L-1時，其對B16F10細胞的抑制率為15.1%，乙酰紫草素濃度為0.5 μmol·L-1時，抑制率為12.3%，當以這兩種藥物濃度共同作用于B16F10細胞時，抑制率達到37.7%，明顯高于單一用藥的抑制率。

Fig 3　Changes in melanoma cell viability by afterinvitroacetylshikonin,pterostilbene and combination of both±s,n=3)

Fig 4　Effect of treatment on morphological changes of B16F10 cells

A:Morphological changes of B16F10 treated with pterostilbene, acetylshikonin, and combination of both under microscope (×200);B: Morphological changes of B16F10 treated with pterostilbene, acetylshikonin, and combination of both observed by Hoechst 33258 stain(×400)

3.3聯合用藥誘導B16F10細胞凋亡形態變化

普通光鏡下觀察正常組、紫檀茋組、乙酰紫草素組、聯合用藥組，可以看到給藥后，細胞增殖受到不同程度的抑制，以聯合給藥組的抑制程度最為明顯。細胞核DNA經Hoechst熒光試劑染色后，聯合用藥組出現了凋亡現象，核固縮、碎裂及凋亡小泡不均一化形態。紫檀茋組基本上沒出現凋亡現象，乙酰紫草素有凋亡現象，但較聯合用藥組凋亡現象少。見Fig 4。

3.4聯合用藥誘導B16F10細胞凋亡率明顯升高

由Fig 5可知，20 μmol·L-1的紫檀茋處理細胞24 h后細胞凋亡率為3.4%，與對照組的3.0%相差不大。在相同條件下，0.5 μmol·L-1的乙酰紫草素的凋亡率為6.7%。二者聯合用藥后凋亡率明顯升高，為11.5%(P<0.05)且有部分晚期凋亡的細胞。

3.5聯合用藥致B16F10細胞G1期阻滯，減少G2/M期

20 μmol·L-1紫檀茋和0.5 μmol·L-1乙酰紫草素單藥作用于細胞24 h后，檢測到G1期細胞比例分別為(67.3±2.5)%和(56.0±1.6)%，G2/M期細胞比例分別為(9.6±1.4)%和(10.3±3.5)%，紫檀茋可以引起細胞的G1期阻滯(P<0.05)。聯合用藥組G1期細胞比例為(72.9±2.4)%，G2/M期為(6.5±1.4)%，從中可以看到聯合用藥引起G1期明顯阻滯，與正常組相比差異有顯著性(P<0.01)，同時減少G2/M期細胞比例(P<0.05)，見Fig 6。

Fig 5　Pterostilbene, acetylshikonin and combination of both induced apoptosis in B16F10 cells(n=3)

*P<0.05vscontrol

3.

3.6RT-PCR法檢測細胞周期及凋亡相關蛋白mRNA表達的變化

20 μmol·L-1的紫檀茋和0.5 μmol·L-1乙酰紫草素分別處理B16F10細胞，隨作用時間延長p53、p21及Bax的mRNA的表達均逐漸增加，Cyclin E、CDK2、Bcl-2的mRNA的表達逐漸降低。聯合給藥組隨著給藥時間的延長，p53、p21及Bax的mRNA的表達逐漸增加，Cyclin E、CDK2、Bcl-2的mRNA的表達逐漸降低，其中p53、Bax及Bcl-2表達差異大于單藥組(Fig 7)。

Fig 6　The cell cycle of B16F10 cells treated with acetylshikonin, pterostilbene and combination of both by flow±s,n=3)

*P<0.05,**P<0.01 treated groupvscontrol

3.7聯合用藥對皮內黑色素移植瘤具有明顯的抑瘤作用

從Fig 8可知，環磷酰胺組的抑瘤率為67.2%，對黑色素移植瘤的生長有明顯的抑制作用。紫檀茋組和乙酰紫草素組的瘤塊大小明顯小于模型組，抑瘤率分別為13.4%和12.7%，聯合用藥組的瘤塊大小明顯小于任一單藥用藥組，抑瘤率為19.9%(P<0.05)。

4討論

惡性黑色素瘤是皮膚中產生的最嚴重的癌癥，其發病率也比其他癌癥更迅速，黑色素瘤的發病危險系數與總體死亡率逐年上升，并對化療的反應很差。近年來，天然產物以毒性低、藥源豐富等特點受到人們的廣泛關注。

馬錢子蜈蚣膏對皮膚癌有很好的療效，從中篩選出的紫檀茋(甲基化的茋類結構)具有抗炎、雌激素受體激動等較出色生物活性，同時兼具較好的生物利用度和親脂性[4]，但是紫檀茋細胞毒活性低。另一個篩出的乙酰紫草素(萘醌結構)是紫草的主要活性成分[3,6]，細胞毒活性高，藥物毒性大。在本實驗中，細胞毒實驗結果顯示，紫檀茋和乙酰紫草素均能有效地抑制B16F10細胞的增殖，協同作用效果更加明顯，且呈現濃度依賴性。

通過TCMSP化合物-靶點關系數據庫預測出紫檀茋和乙酰紫草素的相關靶點，紫檀茋有14個靶點與周期相關[14]，乙酰紫草素有12個靶點與凋亡相關[11]，同時這兩個化合物有13個靶點與p53通路相關[15-16]。在后續實驗中發現紫檀茋作用于B16F10細胞后，凋亡率沒有增加，而聯合用藥后凋亡率較單用藥組明顯升高，且有晚期凋亡的出現，這現象與增加了促凋亡基因Bax的表達，降低抗凋亡基因Bcl-2的表達有關，紫檀茋這兩個基因的表達變化不明顯。同時聯合用藥可以引起G1期明顯阻滯，降低CDK2和Cyclin E基因的表達。

Fig 7　Expression of cell cycle progression and apoptosis related mRNA assessed by semi-quantitative RT-PCR.

Fig 8　Effects of pterostilbene, acetylshikonin and combination of both on carcinoma inhibition rate induced by melanoma(n=6).

*P<0.05,**P<0.01 treated groupvsmodel group

p53腫瘤抑制蛋白是一個多功能的轉錄因子，它調控增殖、細胞周期檢查點和凋亡的細胞過程。細胞周期阻滯、細胞凋亡及衰老是公認的p53抑制腫瘤形成的主要機制[16]。實驗結果可知紫檀茋和乙酰紫草素的協同作用較好，推測其作用機制為通過激活p53信號通路，增加p53及p21基因的表達，誘導周期阻滯和凋亡。

在體內黑色素移植瘤實驗中，本研究發現紫檀茋和乙酰紫草素的共同給藥在一定程度上能抑制黑色素移植瘤的生長。紫檀茋和乙酰紫草素在其抑制率較低的濃度共同給藥時，就能達到很好的抑制B16F10細胞增殖的效果，并具有一定協同作用，這有利于降低藥物的毒性反應。紫檀茋和乙酰紫草素可通過改變細胞周期分布，促進細胞凋亡，激活p53信號通路，從而產生協同抑制作用，但對此機制仍需更深層次的研究。

(致謝：本研究在石河子大學藥學院新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室完成。衷心感謝導師張波老師和本課題研究中給予我關懷和支持的同學！)

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The synergistic antiproliferative effect of pterostilbene and acetylshikonin on B16F10 cells

CHEN Hong1,2,ZHANG Shan-shan1,2,DONG Jin-lei1,2,ZHONG Jing1,2, WANG Xiao-qin1, ZHANG Bo1,2

(1.SchoolofPharmaceutics; 2.KeyLaboratoryofXinjiangEndemicPhytomedicineResources,MinistryofEducation,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832002,China)

Abstract:AimTo evaluate the synergistic effect of anti-tumor by the pterostilbene and acetylshikonin acting on B16F10 cells and investigate the interrelated mechanisms.MethodsThe research screened and analyzed the target-related of pterostilbene and acetylshikonin by system-pharmacological methods. The proliferative inhibition rate of B16F10 cells were measured by MTT. The apoptosis in B16F10 cells were proved by both cellular morphological and biochemical methods. The expression of apoptotic genes were assessed via RT-PCR. The apoptotic rate and cell cycle were measured by flow cytometry. Melanoma models were established in C57BL/6 mice, and the inhibitory rate of tumor growth was measured.ResultsThe 14 targets of pterostilbene were closely related to cell cycle, acetylshikonin′s 12 targets displayed a relationship with apoptosis, and correlated with p53 signaling pathway. Pterostilbene along with acetylshikonin significantly inhibited cell proliferation of B16F10 cells in a dose-dependent way and resulted a remarkable synergistic effect. The apoptotic rate reached highest with a blocked-cell cycle at G1phase in the co-treatment group. The RT-PCR results showed that the expressions of p53, Bax and p21 were up-regulated and the expressions of Bcl-2, CDK2 and Cyclin E were down-regulated with time. The changes of p53, Bax and Bcl-2 were obvious in combined treated group. All treatmentsinvivoshowed different tumor inhibition rates while co-treatment group showed highest.ConclusionPterostilbene cooperated with acetylshikonin inhibits the proliferation in B16F10 cells, and activates the p53 signaling pathway to induce the B16F10 cells apoptosis and a cell cycle arrest.

Key words:melanoma; pterostilbene; acetylshikonin; drug combination; apoptosis; cell cycle; tumor inhibition rate

收稿日期：2016-01-06,修回稿日期：2016-02-26

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81460566)；兵團醫藥專項(No 2014BA029)；石河子大學對口支援高校名師“結對子”計劃資助(No SDJDZ201503)

作者簡介：陳虹(1989-)，女，碩士生，研究方向：腫瘤藥理學，E-mail:541103537@qq.com;

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.06.016

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)06-0818-07

中國圖書分類號：R284.1；R329.24；R329.25；R739.5

網絡出版時間：2016-5-25 15:39網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160525.1539.032.html

張波(1978-)，男，博士，教授，研究方向：系統藥理學，通訊作者，E-mail:bozhang_lzu@126.com