國產瑪咖中腺苷含量的高效液相色譜分析

金文聞，陳雪敏，楊 飄，汪 巨，陳 慧，張之會，余龍江,*（.華中科技大學生命科學與技術學院，資源生物學與生物技術研究所，湖北 武漢　007；2.武漢生物技術研究院，湖北 武漢　0075；.武昌首義學院，湖北 武漢　006；.麗江百歲坊生物科技開發有限公司，云南 麗江　6700）

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國產瑪咖中腺苷含量的高效液相色譜分析

金文聞1,2，陳雪敏1,2，楊 飄3，汪 巨1，陳 慧1，張之會4，余龍江1,2,*
（1.華中科技大學生命科學與技術學院，資源生物學與生物技術研究所，湖北 武漢430074；2.武漢生物技術研究院，湖北 武漢430075；3.武昌首義學院，湖北 武漢430064；4.麗江百歲坊生物科技開發有限公司，云南 麗江674100）

摘 要：目的：建立一種瑪咖中腺苷的高效液相色譜（high performanc e liquid chromatography，HPLC）檢測技術，并根據 海拔、組織部位、干燥處理方法及表皮顏色差異對國產瑪咖中腺苷含量進行分析。方法：用10%的 甲醇溶液為提取溶劑提取瑪咖中的腺苷，采用Waters SunfireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇-水（10∶90，V/V）為流動相，流速1.00 mL/min，紫外檢測波長260 nm，柱溫2 6 ℃為條件進行腺苷的HPLC含量測定，并用該方法對多個瑪咖樣本進行了腺苷含量分析；結果：該方法顯示腺苷含量在2.81～90 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系（R2為0.999 4），精密度較高（相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.728 3%）、重復性較好（RSD為1.745%），樣品溶液24 h內的穩定性好（RSD為1.069%），平均加樣回收率為99.76%（RSD為0.48%）。根據不同瑪咖樣品檢測結果發現，腺苷含量受瑪咖顏色和海拔的影響較大，而且干燥處理方法和組織部位影響更大。結論：HPLC法適合瑪咖中腺苷成分的含量測定，可用于瑪咖原料的質量控制。

關鍵詞：瑪咖；腺苷；高效液相色譜；質量控制

金文聞, 陳雪敏, 楊飄, 等. 國產瑪咖中腺苷含量的高效液相色譜分析[J]. 食品科學, 2016, 37(12): 148-151. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612026. http://www.spkx.net.cn

JIN Wenwen, CHEN Xuemin, YANG Piao, et al. Determination of adenosine in domestic maca by high performance liquid chromatography[J]. Food Science, 2016, 37(12): 148-151. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612026. http://www.spkx.net.cn

瑪咖是十字花科（Brassicaceae）獨行菜屬（Lepidium）一年生或兩年生草本植物Lepidium meyenii Walpers的中文音譯名，其英文簡稱“Maca”，原產于南美秘魯海拔3 500 m以上的安第斯山區[1]，十多年前在我國引種成功，在我國西部高原省份如云南、西藏、新疆、四川等有大面積種植。長期以來，藥食兩用植物瑪咖被認為能增強精力和耐力、抗壓力、提高生育力[2]，同時可用于緩解女性更年期綜合征和預防骨質疏松[3-4]。瑪咖富含多種營養成分，如蛋白質、氨基酸、膳食纖維、多糖、礦物質、多種維生素等[5-6]。此外，瑪咖還含有瑪咖酰胺、瑪咖烯、芥子油苷、甾醇、多酚、黃酮、咪唑生物堿、異硫氰酸芐酯等活性成分[2,7]，這些活性成分大多可以采用先進手段實現精確定性和含量檢測[8-13]，為揭示瑪咖功效物質基礎提供了重要手段。因此，發掘更多的瑪咖化學成分和檢測手段對瑪咖功效研究和瑪咖保健食品開發意義重大。

最近幾年瑪咖獲批我國新資源食品，以瑪咖為原料的保健食品申報也逐漸增多，其中緩解體力疲勞是瑪咖重要的功能之一，而具有相同功能的冬蟲夏草[14-15]、人參[16]、靈芝[17]等均含有腺苷，并常將其作為重要功效成分宣稱，市場上也常把瑪咖與這些保健食品進行類比，所以對于瑪咖中腺苷成分分析很有必要。鄭茜等[18]從吉林產瑪咖根莖中分離純化出腺苷，并通過理化性質和波譜數據對其進行了結構鑒定。但目前專門針對瑪咖尤其是國產瑪咖中腺苷的檢測研究鮮見報道。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）技術是目前檢測食品中腺苷最為普遍的方法[19-25]，本實驗以國產瑪咖的代表云南麗江產瑪咖為研究對象，建立瑪咖中腺苷的提取分離及其HPLC檢測技術，并根據海拔、組織部位、干燥處理方法及表皮顏色的差異對瑪咖樣本中腺苷含量進行分析，初步考察國產瑪咖中腺苷含量及部分影響因素，以期能為瑪咖功效研究、加工應用及質量控制提供參考和檢測手段。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

瑪咖產自云南麗江，2014年12月在麗江百歲坊生物科技開發有限公司-華中科技大學瑪咖聯合種植基地采收，經黃岡師范學院項俊教授鑒定為Lepidium meyenii；采集瑪咖樣本包括不同海拔（黃色瑪咖根，海拔分別為3 200、2 800、2 400 m，整根曬干），不同組織部位（海拔2 800 m的紫色瑪咖全株，采收后剪切收獲須根和葉，然后刀削獲取2 mm左右厚度的皮部，去皮肉質切成約3 mm厚度的片，全部組織樣本采用真空冷凍干燥），不同干燥處理方式（海拔2 800 m的黃色瑪咖根，采后分別用切片凍干、切片曬干、整根曬干），不同表皮顏色（海拔2 800 m，采收不同顏色瑪咖根，切片凍干），所有瑪咖樣品需粉碎過100 目篩，于干燥器內常溫保存備用。

腺苷對照品A9251-1G（純度≥99%）美國Sigma公司；提取用甲醇為分析純，HPLC檢測用甲醇為色譜純，水為超純水。

1.2儀器與設備

1525-F型高效液相色譜儀美國Waters公司；Mettler A E100型分析天平武漢永盛科技有限公司；恒溫磁力攪拌水浴鍋、SHB-IIIA循環水式真空泵鞏義市予華儀器有限責任公司；RE-2000B旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠；GL-21M高速冷凍離心機湖南湘儀離心機儀器有限公司；超聲波提取儀寧波新芝生物科技股份有限公司；恒溫鼓風干燥箱杭州藍天化驗儀器廠；超純水儀四川卓越水處理設備有限公司。

1.3方法

1.3.1瑪咖樣品中腺苷的提取過程

用分析天平稱取瑪咖干粉1.000 g至250 mL圓底燒瓶中，按照1∶50的料液比加入10%的甲醇溶液，設定提取溫度55 ℃，恒溫水浴，攪拌回流30 min[26-31]；然后以8 000 r/min的轉速離心10 min，倒出上清液，將殘渣按上述方法，重復操作2 次。合并3 次的上清液，用旋轉蒸發儀于55 ℃條件下減壓濃縮得浸膏，即為瑪咖腺苷提取物。

1.3.2對照品溶液的制備

用分析天平精密稱取腺苷對照品適量，用少量超純水溶解后，轉移至10 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度，配制成質量濃度為90 μg/mL的對照品溶液，備用。

1.3.3供試品溶液的制備

向1.3.1節得到的瑪咖腺苷提取物中加入少許10%的甲醇溶液，超聲溶解后，以5 000 r/min的轉速離心，取上清液轉移至10 mL容量瓶中定容至刻度，備用。

1.3.4色譜條件

色譜柱：Waters Sunfire C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（10∶90，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：26 ℃；進樣量：20 μL；理論塔板數按腺苷峰計算不少于3 000。

1.3.5不同瑪咖樣品中腺苷含量分析

按照1.1節選取不同海拔、不同組織部位、不同干燥處理方法以及不同表皮顏色的瑪咖樣品，每個樣品平行取樣3 份，按以上提取及檢測條件測定腺苷含量。

2　結果與分析

2.1專屬性考察

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，按照1.3.4節中的色譜條件，進行HPLC檢測。結果可見腺苷對照品與供試品中腺苷的保留時間分別為17.04 min和17.11 min，且供試品中腺苷與其他組分的色譜峰可達到良好分離，結果見圖1。

圖1　腺苷標準品（A）與瑪咖提取物中腺苷（B）的HPLC圖譜Fig. 1　HPLC of adenosine standard (A) and maca sample (B)

2.2線性關系考察

精密吸取1.3.2節中制備的對照品溶液用流動相逐級稀釋，制成質量濃度分別為90、45、22.5、11.25、5.62 μg/mL與2.81 μg/mL的對照品溶液，進樣量為20 μL，按上述色譜條件進行分析，以對照品質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=87.144X＋95.327（R2=0.999 4），結果表明腺苷在2.81～90 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3精密度實驗結果

按1.3.4節色譜條件，分別精密吸取腺苷對照品溶液（90 μg/mL）20 μL，連續進樣5 次，測定腺苷的峰面積，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.728 3%，表明儀器精密度良好。

2.4重復性實驗結果

取同一批海拔2 800 m的黃色曬干瑪咖干粉5 份，按1.3.1節中腺苷的提取方法，將制備好的供試品溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣量為20 μL，按照上述色譜條件測定，每個樣品重復進樣2 次，取其峰面積的平均值，代入標準曲線方程，得5 份樣品中腺苷的平均含量為63.84 μg/g，RSD為1.745%，表明方法重復性較好。

2.5穩定性實驗結果

任意取1.3.3節中制備的供試品溶液一份，分別在9、12、15、18、24 h時進樣測定其峰面積，RSD為1.069%，表明樣品溶液24 h內較穩定。

2.6加樣回收率實驗結果

精密稱取海拔2 800 m的黃色曬干瑪咖干粉9 份，每份1.000 g，分別精密加入1.3.2節下制備的腺苷對照品標準溶液（90 μg/mL）：低、中、高質量濃度每一份平行實驗2 次，按照1.3.1節中供試品溶液制備方法制備，然后按上述色譜條件，進樣量20 μL，測定各個峰面積，計算加樣回收率，結果見表1。本實驗建立的瑪咖中腺苷的提取與檢測方法準確度較好。

表1　樣品含量測定及加樣回收率實驗（n=9）Table 1 Adenosine contents of real samples and its spiked recovery (n=9)

2.7不同瑪咖樣品中腺苷檢測結果

表2　不同海拔的瑪咖樣品中腺苷含量Table 2 Adenosine contents in maca samples grown at different altitudes

表3　不同部位的瑪咖樣品中腺苷含量Table 3 Adenosine contents in different maca tissues

表4　不同干燥處理方法的瑪咖樣品中腺苷含量Table 4 Adenosine contents in maca samples dried by different methods

表5　不同品種的瑪咖樣品中腺苷含量Table 5 Adenosine contents in maca varieties with different skin colors

由表2～5可見，通過對不同瑪咖樣品中腺苷的檢測可以發現，瑪咖中腺苷含量受到很多因素的影響。在確保種苗品種、種植管理、采收加工等相同的情況下，從不同海拔瑪咖基地采收的瑪咖中腺苷含量有一定差異，其中隨著海拔提高，腺苷含量逐漸提高；腺苷在瑪咖不同組織部位中積累有差異，而且靠近外層或皮質較多的組織中含量低，含量最高的是瑪咖去皮肉質（147.35 μg/g），最低的則是瑪咖葉（38.23 μg/g）；由于腺苷的熱穩定性較差，本實驗也考察了幾種干燥處理方式對瑪咖腺苷含量的影響，其中真空冷凍干燥所得瑪咖腺苷含量最高，整根曬干其次，損失最大的是切片干燥，因此瑪咖加工中要從溫度和控制氧化等方面入手，盡量保持腺苷含量；另外，市面上不同顏色瑪咖的價格差異很大，因此本實驗也對同一基地幾種不同顏色瑪咖中腺苷含量進行了分析，可見黑色瑪咖腺苷含量最高，其次是紫色瑪咖，含量最低的是黃色瑪咖，但相對組織部位和干燥加工對腺苷含量的影響來說，不同顏色瑪咖的腺苷差異不大。以上檢測結果雖然還有待更大樣本量的分析，但也足夠提示在利用腺苷作為活性成分開發瑪咖抗疲勞產品時，要密切關注瑪咖原料的選擇及其采后加工工藝。

3　結 論

腺苷是人參、靈芝、冬蟲夏草等多種重要生物資源的活性成分，具有重要的生理活性，如舒張血管、降低血壓、減慢心率、抑制血小板凝集和改善心腦血液循環等作用。腺苷含量的測定已成為許多藥材或滋補品質量監控的指標。本實驗成功地建立了一種瑪咖干粉中腺苷的HPLC檢測技術，對國產瑪咖進行腺苷成分的分析和報道。通過實驗結果發現，該方法重復性較好、穩定性良好，可以用于瑪咖中腺苷的含量測定。此外，通過對云南麗江多種瑪咖樣品中腺苷含量的檢測發現，腺苷含量與瑪咖種植地海拔、表皮顏色，尤其是組織部位和干燥處理方法密切相關，且多數樣品腺苷含量較為豐富，結合腺苷具有的活性作用，暗示腺苷很可能是瑪咖提高精力、抗疲勞的潛在功效成分之一，通過進一步研究，腺苷有望成為繼支鏈氨基酸、鋅、牛磺酸等瑪咖抗疲勞活性成分之后，又一種用于評價瑪咖抗疲勞功能的重要指標性成分。

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Determination of Adenosine in Domestic Maca by High Performance Liquid Chromatography

JIN Wenwen1,2, CHEN Xuemin1,2, YANG Piao3, WANG Ju1, CHEN Hui1, ZHANG Zhihui4, YU Longjiang1,2,*
(1. Institute of Resource Biology and Biotechnology, College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan430074, China; 2. Wuhan Institute of Biotechnology, Wuhan430075, China; 3. Wuchang Shouyi University, Wuhan430064, China; 4. Lijiang Baisuifang Biot echnology Development Co. Ltd., Lijiang67 4100, China)

Abstract:Objective: To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for detecting the adenosine content of Lepidium meyenii (maca) and utilize it to detect and the adenosine contents of domestic maca grown at different altitudes, its different tissues, dried samples obtained using drying methods and maca varieties with different skin colors. Methods: A 10% aqueous methanol solution was used as the extraction solvent to extract the adenosine in maca. The HPLC analysis was performed using a Waters SunfireTMC18column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm). The mobile phase was CH3OH-H2O (10:90, V/V) at a flow rate of 1.00 mL/min. The detection wavelength was 260 nm, and the column temperature was 26 ℃. Multiple samples were analyzed under these chromatographic conditions. Results: The method had good linearity in the concentration range of 2.81–90 μg/mL (R2=0.999 4), high precision and good reproducibility with relative standard deviation (RSD) values of 0.728 3% and 1.745%, respectively. The sample solution was stable within 24 h (RSD = 1.069%), and the average recovery of was 99.76% with a RSD value of 0.48% (n = 9). The analytical results of different maca samples showed that different altitudes and differently colored maca varieties had great influences on the content of adenosine while different drying methods and different tissues had more significant impacts. Conclusions: The HPLC method is suitable for detecting the content of adenosine in maca for the quality control of maca materials.

Key words:maca; adenosine; HPLC; quality control

收稿日期：2015-08-31

基金項目：華中科技大學校企重大合作項目（20130901）；華中科技大學自主創新研究基金前沿探索項目（2015TS091）；國家基礎科學人才培養基金項目（J1103514）

作者簡介：金文聞（1976—），男，講師，博士，研究方向為天然產物化學。E-mail：jww@hust.edu.cn

*通信作者：余龍江（1966—），男，教授，博士，研究方向為資源生物學與生物技術。E-mail：yulongjiang@hust.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612026

中圖分類號：O657.72；TS255.7

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0148-04引文格式：