變波長高效液相色譜法測定布洛芬混懸液中6種防腐劑的含量

王　發，王蓀璇，劉雪峰，韓喆青

(陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安　710061)

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變波長高效液相色譜法測定布洛芬混懸液中6種防腐劑的含量

王發，王蓀璇，劉雪峰，韓喆青

(陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安710061)

摘要：目的建立布洛芬混懸液中6種常用防腐劑的分離測定方法。方法Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨溶液，梯度洗脫，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃，檢測波長：變波長。用保留時間定性，以峰面積按標準曲線法定量。結果6種防腐劑分離良好，在0.002～0.05 g·L-1的質量濃度范圍內線性關系良好(r≥0.999)，平均加樣回收率97.2%～100.6%， RSD≤2.2%。結論該法簡單、準確，可用于布洛芬混懸液中防腐劑的定性和定量檢測。

關鍵詞：防腐劑,藥物/分析；色譜法,高壓液相；布洛芬；懸液

布洛芬屬苯丙酸類非甾體抗炎藥,具有解熱,鎮痛,抗炎作用。布洛芬混懸液臨床上主要應用于兒童普通感冒或流行性感冒引起的發燒，也用于緩解兒童輕至中度疼痛，如頭痛、關節痛、牙痛、神經痛等[1-2]。口服液體制劑通常選用苯甲酸類和羥苯酯類作為防腐劑。防腐劑作為藥物制劑中的一個重要組分，大多數情況下是安全的。但是，近年來大量的臨床觀察和實驗資料表明，這些化學物質本身存在著一定的刺激性和毒性，被人體吸收后會產生副作用，危害人們的身體健康。目前食品安全國家標準GB2760-2014對食品中可用的防腐劑的種類和限度進行了規定[3]，而藥品中防腐劑種類和限度還未見明確規定，因此制定藥品中防腐劑的含量測定方法，在保障臨床用藥的安全性方面具有重要意義。目前國內布洛芬混懸液生產企業眾多，所加防腐劑的種類與濃度亦各不相同，已有文獻報道[4]的方法僅限于苯甲酸的測定，不適用于多品種多批次的快速篩查。通過查閱相關企業的藥品說明書與文獻資料[6-8]，本文建立了6種常見防腐劑的分離測定方法，并采用此方法對國內7家不同企業的22批產品進行了測定。

1儀器與試藥

1.1儀器沃特世2695高效液相色譜儀，沃特世2489紫外檢測器，梅特勒AE-240型電子分析天平，同泰聯TTL-101型實驗室專用超純水系統。

1.2試劑和樣品苯甲酸標準品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號：100419-200301)、山梨酸標準品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號：205-9401)、羥苯甲酯標準品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號：100278-201103，99.6%)、羥苯乙酯標準品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號：100847-201102，99.9%)、羥苯丙酯標準品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號：110009-200503，99.4%)、羥苯丁酯標準品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號：110792-200503)，甲醇為色譜純，水為高純水，乙酸銨為分析純；布洛芬混懸液分別由A公司(批號：20150501)，B公司(批號：150102)，C公司(批號：50214063、50215021、50215055、50315002、50315013、50315022、50315026)，D公司(批號：140833、14094、141104、150518、150523、150533)，E公司(批號：141201)，F公司(批號：20150317-2、20150527-2、20150606-1)，G公司(批號：C141216、C150112、C150308)等7家企業提供，共22批。

2方法與結果

2.1色譜條件色譜柱：Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：以甲醇為流動相A，0.02 mol·L-1乙酸銨溶液為流動相B；梯度洗脫，0～6 min，30%～30% A，6～15 min，30%～70% A，15～22 min，70%～70% A，22～25 min，70%～30% A，25～30 min，30%～30% A；變波長檢測模式：0～5.5 min，檢測波長為230 nm，5.5～30.0 min，檢測波長為254 nm；柱溫：30 ℃，流速:1.0 mL·min-1,進樣體積:10 μL。

2.2溶液的制備

2.2.1供試品溶液的制備用內容量移液管精密量取供試品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，用10%甲醇溶液30 mL洗出吸管內壁的附著液，洗液并入量瓶中，充分振搖使溶解，加10%甲醇溶液至刻度，搖勻，濾過，取續濾液即得供試品溶液。

2.2.2對照品儲備溶液的制備精密稱定苯甲酸標準品10.51 mg、山梨酸標準品10.80 mg、羥苯甲酯標準品11.16 mg(實際含羥苯甲酯為11.12 mg)、羥苯乙酯標準品10.53 mg(實際含羥苯乙酯為10.52 mg)、羥苯丙酯標準品10.28 mg(實際含羥苯丙酯為10.22mg)、羥苯丁酯標準品11.35 mg，置100 mL量瓶中，用10%甲醇溶液溶解并稀釋到刻度，搖勻，作為對照品儲備液。

2.3線性關系分別精密量取對照品儲備溶液適量，用10%甲醇溶液稀釋成含苯甲酸依次為0.002 102、0.005 255、0.010 51、0.021 02、0.052 55 g·L-1，山梨酸依次為0.002 160、0.005 400、0.010 80、0.021 60、0.054 00 g·L-1，羥苯甲酯依次為0.002 224、0.005 560、0.011 12、0.022 24、0.055 60 g·L-1，羥苯乙酯依次為0.002 104、0.005 260、0.010 52、0.021 04、0.052 60 g·L-1，羥苯丙酯依次為0.002 044、0.005 110、0.010 22、0.020 44、0.051 10 g·L-1，羥苯丁酯依次為0.002 270、0.005 675、0.011 35、0.022 70、0.056 75 g·L-1的線性對照品溶液，按照上述色譜條件分別進樣10 μL測定，以峰面積Y對質量濃度X作線性回歸，得苯甲酸、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯的回歸方程及線性范圍見表1。

表1　6種防腐劑標準曲線的回歸方程及線性范圍

2.4檢測限精密量取不同體積對照品儲備液，用10%甲醇溶液逐步稀釋，按上述色譜方法進樣，記錄色譜圖，當所測的信噪比為3∶1時，苯甲酸、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯對應的質量濃度分別為0.000 210 2、0.000 108 0、0.000 148 3、0.000 140 3、0.000 136 3、0.000 227 0 g·L-1。

2.5精密度實驗取含苯甲酸、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯濃度分別為0.010 51、0.010 80、0.011 12、0.010 52、0.010 22、0.011 35 g·L-1的對照品溶液，連續進樣6次，按上述色譜條件分別測定，結果測得6次苯甲酸、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯的峰面積的RSD均在0.3%以內。實驗結果表明，本方法精密度良好。

2.6重復性實驗取批號為50214063的樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液6份，按上述色譜條件分別進樣測定，將測得的峰面積代入標準曲線計算，結果本品中苯甲酸的含量為1.7 g·L-1，RSD為2.0%，山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯均未檢出。實驗結果表明，本方法重復性良好。

2.7回收率實驗精密量取已知苯甲酸、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯含量的批號為20150501的樣品6份，每份1 mL，置100 mL量瓶中，加對照品儲備液10 mL，用10%甲醇溶液稀釋到刻度，搖勻，濾過，取續濾液，按上述色譜條件分別進樣測定，將測得的峰面積代入標準曲線計算回收率。苯甲酸、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯、羥苯丁酯回收率分別為99.5%，97.2%，100.4%，100.6%，100.3%和100.1%，RSD分別為1.5%，1.7%，1.4%，2.2%，2.0%和1.3%。實驗結果表明，本方法回收率良好。

2.8樣品測試取樣品，按“2.2”項下供試品溶液的制備方法制樣測定，對定量時超出標準曲線范圍的樣品溶液用10%甲醇溶液準確稀釋后再測定，結果22批樣品中均檢出有防腐劑，結果見表2，色譜圖見圖1。

表2　防腐劑測定結果/g·L-1

注：1.苯甲酸；2.山梨酸；3.羥苯甲酯；4.羥苯乙酯；5.羥苯丙酯；6.羥苯丁酯；A.批號為20150501的樣品溶液色譜圖；B.批號為150102的樣品溶液色譜圖；C.批號為50214063的樣品溶液色譜圖；D.批號為140833的樣品溶液色譜圖；E.批號為141201的樣品溶液色譜圖；F.批號為20150317-2的樣品溶液色譜圖；G.批號為C141216的樣品溶液色譜圖；H.對照品溶液色譜圖；I.空白溶液色譜圖。

圖1典型色譜圖

3討論

3.1變波長檢測程序的設計采用UV-HPLC法進行分析檢測時，一般采用目標化合物的最大吸收波長來提高檢測靈敏度。但在多組分測定時，往往由于目標化合物的最大吸收波長差異較大，因此需要選擇合適的波長以保證所有組分都能達到一定的靈敏度。通過掃描，苯甲酸的最大吸收波長為230 nm、山梨酸、羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯和羥苯丁酯的最大吸收波長為254 nm。對于沃特世2489紫外檢測器，可以選擇雙通道(但數據采樣率只有每秒1點)，也可選擇程序變波長(數據采樣率最高可設每秒10點)以提高色譜峰的逼真度。根據6種化合物在本實驗色譜條件下的出峰時間，設計變波長檢測程序如下：0～5.5 min，檢測波長230 nm，檢測苯甲酸；5.5～30.0 min，檢測波長254 nm，檢測其他5種防腐劑，選擇在不同時間段分別用各組分的最佳吸收波長進行檢測，不但可以提高檢測靈敏度，還能減小干擾。

3.2梯度洗脫程序的優化由于苯甲酸和山梨酸的相對分子質量和極性非常接近，而羥苯酯類在C18柱上保留性又較強，因此需要采用梯度洗脫的方法，才能在適宜的時間內分離這6種防腐劑。試驗過程中，曾對相關文獻中使用的流動相篩選和優化，最終選擇了甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨溶液體系進行梯度洗脫。首先在較低的有機相比例(30%)保持6 min，使苯甲酸和山梨酸達到基線分離，然后以適宜的速率使有機相比列達到70%并保持7 min，使4種羥苯酯類和其他組分流出。在此梯度洗脫條件下，6種防腐劑分離良好，峰形良好，其他組分無干擾。

3.3檢測結果的分析22批樣品中均檢出了防腐劑，同一企業防腐劑的使用種類和濃度基本保持穩定，但不同企業之間濃度差異較大，值得關注。《中國藥典》只是規定了糖漿劑中防腐劑的種類和限量[9]，但缺少相應的測定方法,容易導致部分企業在防腐劑的使用上缺乏嚴格的管理，因此應加強對防腐劑使用的監管，以確保廣大人民群眾用藥安全有效。

參考文獻

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[9]國家藥典委員會.中國藥典(四部)[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：20.

Simultaneous determination of six preservatives in ibuprofen suspension by HPLC with variable wavelength UV detection

WANG Fa，WANG Sun-xuan，LIU Xue-feng，et al

(ShaanxiInstituteforFoodandDrugControl,Xi′an,Shaanxi710061,China)

Abstract:ObjectiveA method of simultaneous determination of six preservatives in ibuprofen suspension by HPLC with variable wavelength UV detection was established.MethodsThe Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)column was used,methanol-0.02 mol·L-1ammonium acetate was used as mobile phase in gradient elution mode at the flow rate of 1.0 mL·min-1,and the temperature of column was 30 ℃.The analyte was determinedwith variable wavelength detector.With the qualitative retention time,the peak area was quantified by the standard curve method.ResultsSix preservatives were well separated,the calibration curves were linear in the range of 0.002～0.05 g·L-1(r≥0.999),and the average recoveries were between 97.2% and 100.6%,RSD≤2.2%.ConclusionsThe method was simple,accurate,so it is proposed for quantitative and qualitative determination of preservatives in ibuprofen suspension.

Key words:Preservatives,pharmaceutical/analysis;Chromatography,high pressure liquid;Ibuprofen;Suspensions

作者簡介：王發，男，副主任藥師，研究方向：藥物分析，E-mail:wangf1974@126.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.014

(收稿日期：2016-03-14，修回日期：2016-05-03)