富氫水對大鼠非酒精性脂肪肝的保護作用*

張景云,王躍會,李佳煒,毛　捷,秦啟忠

(重慶醫科大學:1公共衛生與管理學院；2.實驗教學管理中心　400331)

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富氫水對大鼠非酒精性脂肪肝的保護作用*

張景云1,王躍會1,李佳煒1,毛捷1,秦啟忠2△

(重慶醫科大學:1公共衛生與管理學院；2.實驗教學管理中心400331)

[摘要]目的探討富氫水對大鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)的保護作用及其可能機制。方法以150～180 g SD大鼠為研究對象，分為對照組(C組)、NAFLD組(M組)、非酒精性脂肪肝+富氫水組[(M+H2)組]、富氫水組(H2組)，每組12只；C組和H2組常規飼養，M組和(M+H2)組以高脂飼料+土霉素(10 mg/100 g劑量注射20 mg/mL，每5天1次)暴露建立大鼠NAFLD模型；連續暴露8周后各組隨機選取4只，HE染色檢測肝臟組織病理特征，觀察到脂肪空泡為模型建立成功；采用生化方法檢測各組大鼠外周血丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性；第9周起，各組常規飼養，前兩組注射生理鹽水(每只4 mL/d)，后兩組注射富氫水(每只4 mL/d)，連續腹腔注射24 d后，觀察各組肝臟組織病理特征，并檢測大鼠外周血ALT、MDA水平及SOD活性。結果各組暴露8周后，HE染色顯示：M組和(M+H2)組肝臟組織均有大小不等的脂肪空泡，C組和H2組肝臟組織細胞形態正常，無脂肪空泡；血液檢測顯示：與C組相比，M組和(M+H2)組ALT、MDA水平均顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)。連續注射生理鹽水或富氫水24 d后，HE染色顯示：(M+H2) 組大鼠肝臟組織僅極少部分有脂肪空泡，多數肝細胞形態正常，無明顯損傷；M組大鼠肝臟組織一半以上區域有脂肪浸潤現象，并有脂肪滴出現，肝細胞受損明顯；血液檢測顯示：與M組比較，(M+H2) 組大鼠肝臟中ALT、MDA水平降低(P<0.05)，SOD活性增高(P<0.05)；但與C組相比，(M+H2) 組大鼠肝臟中ALT、MDA水平增高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)。結論成功建立大鼠NAFLD模型，富氫水處理對大鼠NAFLD有一定保護作用，其機制可能與富氫水抗氧化作用有關。

[關鍵詞]富氫水；非酒精性脂肪肝；脂肪空泡；氧化應激

隨著人們生活水平的日益提高,非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的患病率逐年增加，成人NAFLD的患病率已達20%[1]。NAFLD的發生嚴重影響了患者生活質量并增加患心血管疾病、糖尿病等風險，甚至發展成終末期肝病而死亡，這已成為危害人類健康的公共衛生問題[2]。針對NAFLD發生的相關機制研究已成為學術界關注的焦點，但具體機制尚未明了，目前主要以氧化應激和脂質過氧化的“二次打擊學說”為軸心[3]。這提示脂質過氧化和炎癥反應是NAFLD發病過程中的關鍵環節。因此，具有抗炎癥和消除氧自由基的物質可能是防治NAFLD的有效干預措施。富氫水(hydrogen water)中的氫可起到選擇性抗氧化作用和抗炎癥作用，同時氫具有特異性強、不良反應小的特性[4]。因此，本研究擬建立高脂膳食并腹腔注射土霉素建立大鼠NAFLD模型[5]，通過檢測和比較各組大鼠外周血的丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性，觀察大鼠肝臟的組織病理學特征，研究富氫水對NAFLD的防治作用及機制，為富氫水在臨床上的應用提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料選取48只清潔級雌性SD大鼠，體質量150～180 g，重慶醫科大學實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(渝)2012-0001]。標準飼料[許可證號：SCXK(渝)2012-0002]，分籠(4只/籠)，自由飲水，溫度(24±2)℃，12 h光照，明暗交替(8∶00～20∶00明)，常規適應性飼養1周后用于實驗。所有操作過程遵循實驗動物倫理學要求。SOD南京建成生物工程所(生產批號：20150101；貨號：A001-1)；MDA南京建成生物工程所(生產批號：20140923；貨號：A003-1)；ALT試劑盒(速率法)中生北控生物科技股份有限公司(產品批號：201311132181)；注射用鹽酸土霉素，北京賽孚制藥有限公司(生產批號：120201)。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型建立本研究采用成組設計，將SD大鼠分為4組，即對照組(C組)、NAFLD組(M組)、NAFLD+富氫水組[(M+H2)組]、富氫水組(H2組)，每組12只；C組和H2組常規飼養，M組和(M+H2)組以高脂飼料[5]飼養，并按10 mg/100 g劑量注射土霉素(20 mg/mL,每5天1次)，暴露8周后各組選取4只，用HE染色檢測其肝臟組織病理變化，以觀察到脂肪空泡為模型建立成功[6]；第9周起，各組均常規飼養，前兩組腹腔注射生理鹽水每只4 mL/d，后兩組腹腔注射同體積富氫水，連續注射24 d。

1.2.2富氫水制備參照文獻[7]略改，將分析純的鋅粒與稀硫酸(2.5 mol/L)反應制取的氫氣通入浸泡在冰水浴中的0.9%生理鹽水6 h以達到飽和，富氫水現用現制備。

1.2.3實驗儀器低速離心機(LXJ-IIB，上海安亭科學儀器，中國)；純水器(ULPYS-210，成都超純科技有限公司,中國)；漩渦混合儀(XW-80A，海門市其林貝爾儀器制造有限公司，中國)；可見光分光光度計(722s，上海精密科學儀器有限公司，中國)；半自動生化分析儀(PVS-2018，北京普朗新技術有限公司，中國)；冷凍石蠟兩用切片機(KD-2268-VI，金華科迪儀器設備有限公司，中國)。

1.2.4檢測指標及方法大鼠處死前，隔夜禁食，次日稱體質量后，用20%烏拉坦5 mL/kg麻醉大鼠，心臟采血約2 mL備用。采血后37 ℃孵育1～2 h后，3 000 r/min，15 ℃，離心5 min，取上清液備用。

1.2.5肝組織檢測(HE染色)肝組織HE染色制作過程及方法參考文獻[5]。各組大鼠均取肝左葉組織(約1 cm×1 cm×1 cm)，置入4%甲醛溶液中固定備用(其體積約為組織體積的10倍)，先后經75%～100%乙醇梯度脫水，丙酮脫乙醇，二甲苯透明組織，石蠟包埋等，制備待測病理切片。

1.2.6ALT、MDA及SOD活性檢測取大鼠血上清液按ALT試劑盒說明操作，用半自動生化分析儀檢測ALT水平。取大鼠血液血清，嚴格按照MDA試劑盒說明書操作，用可見光分光光度計檢測樣本吸光度，并參照MDA試劑盒說明書計算其MDA含量。取大鼠血液血清，嚴格按照SOD試劑盒說明書操作，用可見光分光光度計檢測樣本吸光度，并參照試劑盒內說明書計算SOD活性。

2結果

2.1一般情況在0～8周NAFLD大鼠造模過程中，C組和H2組大鼠生長及生活狀況正常；M組和(M+H2)組大鼠造模初期出現煩躁、易激怒等表現，造模5周后出現進食量和飲水量減少，毛色暗淡無光澤，抓捕時掙扎劇烈。在第8周至8周+24 d腹腔注射富氫水和生理鹽水過程中，C組大鼠生長及生活狀況正常，H2組在腹腔注射富氫水后出現嗜睡癥狀，1～2 h后活動正常；M組行動遲緩，(M+H2)組大鼠腹腔注射后，出現打轉，活動劇烈的現象。各組大鼠在整個實驗過程中的體質量變化見表1。

表1　各組大鼠體質量結果±s,g)

a：P<0.05，與C組比較；b：P<0.05，與M組比較。

2.2肝臟病理學特征大體觀：在第8周，C組和H2組大鼠肝臟呈現暗紅色，包膜光滑，邊緣銳利，切面光潔。M組和(M+H2)組大鼠腹腔內有大量脂肪組織，肝臟色澤更為暗淡，質地偏硬，體積明顯增大，包膜緊張，邊緣圓頓，切面油膩。HE染色顯示：C組和H2組大鼠肝臟肝小葉結構清晰，細胞索排列整齊，肝血竇正常，肝細胞無明顯病變，核結構清晰；M組和(M+H2)組大鼠肝臟肝小葉分界不清，肝細胞索紊亂，出現程度不同的彌漫性肝細胞脂肪變性，可見大小不等的脂肪滴充滿細胞質(圖1)。生理鹽水或富氫水注射24 d后，C組和H2組肝組織結構完整，細胞索排列整齊，肝竇正常，肝細胞無明顯病變，核結構清晰。(M+H2)組大鼠肝臟脂肪僅有極少部分有脂肪浸潤，肝索整齊，肝竇正常，組織完整，肝細胞無明顯損傷，核結構清晰。M組大鼠肝索較為紊亂，一半以上區域均有脂肪浸潤現象，并有脂肪滴出現，肝細胞體積增大，肝索紊亂，細胞核被推向周邊。

2.3大鼠血液生化檢測第8周，各組血清學檢查顯示：與C組比較，M組和(M+H2)組ALT、MDA水平顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)，見表2。連續注射生理鹽水或富氫水24 d后，與C組比較，M組大鼠ALT水平顯著升高(P<0.05)；(M+H2)組ALT水平顯著低于M組(P<0.05)；與C組與H2組比較，(M+H2)組ALT水平差異無統計學意義(P>0.05)；與C組比較，M組和(M+H2)組的MDA水平升高(P<0.05)，且(M+H2)組的MDA水平低于M組(P<0.05)；與C組比較，M組與(M+H2)組大鼠SOD活性顯著降低(P<0.05)，且(M+H2)組大鼠SOD活性高于M組(P<0.05)，見表3。

圖1　第8周各組大鼠肝臟切片(HE，×400)

組別ALT(U/L)SOD(U/mL)MDA(mmol/mL)C組41.49±13.32246.76±18.792.55±0.13M組87.43±22.95ab121.90±16.49ab4.69±0.37ab(M+H2)組82.93±18.55ab124.38±18.45ab4.59±0.61abH2組41.23±12.35247.14±15.502.58±0.17

a：P<0.05，與C組比較；b：P<0.05，與H2組比較。

表3　8周+24 d各組血清ALT、MDA水平及SOD活性

d：P<0.05，與C組比較；c：P<0.05，與M組比較。

3討論

NAFLD是一種對人體危害嚴重的疾病[8]。NAFLD的發生不僅影響患者的肝膽系統，還與動脈粥樣硬化、多種血液系統疾病、肺部脂肪栓塞、病態肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗等有著密切的聯系[9-11]。同時隨著生活水平的提高及飲食結構的改變，受 NAFLD困擾的人群范圍已從中老年人擴展到青春期的男性和女性[12]。NAFLD可發展為脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化、肝硬化，最終發展為肝細胞癌(HCC)而死亡[13]。隨著病毒性肝炎，特別是乙型肝炎的控制，NAFLD所致HCC比例在持續增加[14]。當今醫療水平條件下尚無治療NAFLD的理想藥物[15]。NAFLD已成為危害人類健康的三大肝病之一，對 NAFLD的防治研究已成當前面臨的重要課題[16]。

在NAFLD所致肝臟損傷中，ALT是一種敏感且重要的標志酶，其水平可反映出肝細胞損傷的程度[17]。SOD是廣泛存在于需氧代謝細胞中一種重要的ROS清除劑，反映了肝細胞抗氧化能力，在機體氧化和抗氧化平衡中有著至關重要的作用[18-19]。MDA反應除可干擾肝內脂質代謝外，還可導致自由基生成增多，使得細胞膜脂質氧化，肝細胞結構異常與功能損害[20]；因此，肝組織中SOD和MDA的改變也是導致脂肪肝的重要因素[18-19]。富氫水中的氫可起到選擇性抗氧化作用和抗炎癥作用[21]，同時氫具有特異性強、不良反應小的特性。在本實驗中，給予大鼠氫鹽水腹腔注射24 d后，與M組比較，(M+H2)組大鼠血清ALT和MDA水平降低和SOD活性增高(P<0.05)；這與文獻報道富氫水干預能夠增強大鼠肝臟的抗氧化能力是一致的[22]。但與C組相比，(M+H2)組在MDA和ALT水平及SOD活性比較，差異有統計學意義(P<0.05)；這提示(M+H2)組未完全恢復到正常水平，這可能與本實驗富氫水處理的時間有關，有待進一步研究。

本實驗中，富氫水處理24 d后，與M組比較，(M+H2)組大鼠大體觀顏色和質地顯著好轉；光鏡下，脂肪空泡減少，肝臟細胞僅有極少部分有脂肪浸潤，肝臟細胞損傷較輕，組織較為完整；但與C組相比，肝索排列相對正常，肝細胞尚未完全恢復；結合血清學指標，(M+H2)組與M組相比有顯著改善，但與C組比較，(M+H2)組相應指標尚未恢復，兩者差異有統計學意義(P<0.05)，這提示富氫水對NAFLD有一定保護作用。

本實驗中，富氫水處理24 d對NAFLD有一定保護作用，但尚未完全使其恢復正常，這可能與富氫水中的氫水平有關，單位時間內作用于肝臟損傷有效部位的劑量不足；或者是富氫水注射時間過短，在24 d內氫分子作用于NAFLD劑量不足，尚不能使肝臟完全恢復。 本研究中，筆者觀察到富氫水顯著改善NAFLD模型中大鼠ALT，MDA水平和SOD活性及相應病理學改變，為富氫水對NAFLD的治療提供實驗依據，其具體機制有待深入研究。

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Hydrogen-rich saline protects against nonalcoholic fatty liver in rat*

Zhang Jingyun1,Wang Yuehui1,Li Jiawei1,Mao Jie1,Qin Qizhong2△

(1.theSchoolofPublicHealthandManagement;2.ExperimentTeachingManagementCenter,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400331,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the protective effect of Hydrogen-rich saline against nonalcoholic fatty liver and its potential mechanism in rats.MethodsFurty-eight SD rats (weight:150-180 g) were randomly divided into control group (C),non-alcoholic fatty liver group (M),non-alcoholic fatty liver+Hydrogen-rich saline group (M+H2),Hydrogen-rich saline group (H2);group C and group H2 were fed with conventional breeding,group M and group(M+H2) were fed with high fat diet +Terramycin (10 mg/100 g.B.W,time/5 d,intraperitoneal injection) to establish the model of nonalcoholic fatty liver disease in rats;four rats were randomly selected from each group after consecutive exposure eight weeks,the pathology characteristics of liver tissue was tested by HE staining,and observed that fat cavitation symbolized the model established successfully.The content of alanine aminotransferase (ALT)，malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) activity in each rat′s peripheral blood was tested by biochemical methods.From the ninth week,each group was starting to be fed with conventional breeding,group (C) and group (M) were treated with normal saline (4 mL/per/d),group (M+H2) and group (H2) were treated with Hydrogen-rich saline (4 mL/per/d);by consecutive intraperitoneal injection 24 days later,observed the change of the pathological features of liver tissue and detected the contents of ALT， MDA,and SOD activity of peripheral blood in rats.ResultsAfter eight weeks,the result of HE staining showed that there were a lot of fat vacuoles in the pathologic section of liver tissue from group M and group (M+H2);in contrast,there were no fat vacuoles were observed in liver tissue from group C and group H2.Blood tests results were showed that compared with group C,the content of ALT and MDA significantly increased in group M and group (M+H2) (P<0.05),and the SOD activity was significantly lower in group M and group (M+H2) (P<0.05).After Hydrogen-rich saline or normal saline injection for 24 days,the results of HE staining showed that only few fat cavitations of rat liver tissue in group (M+H2) was observed without obvious damage of the majority liver tissue in this group;whereas in group M,a lot of lipid deposition account for more than half of this area in these liver tissues,and the liver cells were damaged distinctly.Blood tests were showed that compared with group M rats,the content of ALT，MDA decreased in group (M+H2) (P<0.05),and the activity of SOD increased in group (M+H2) (P<0.05);however,by comparison,the content of ALT，MDA fostered more in group (M+H2) (P<0.05),and the activity of SOD decreased more percentage in group (M+H2) than those in group C(P<0.05),respectively.ConclusionThose results suggest that the model of nonalcoholic fatty liver disease was successfully established in rats,Hydrogen-rich saline treatment has certain protective effect on nonalcoholic fatty liver,and its underlying mechanism related to the antioxidant effective of rich hydrogen water probably.

[Key words]hydrogen water;nonalcoholic fatty liver disease;fat cavitations;oxidative stress

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.17.008

*基金項目：重慶醫科大學創新實驗項目(201442)。

作者簡介：張景云(1992-)，重慶醫科大學2011級預防醫學本科。△通訊作者,Tel:13668083656；E-mail：qqizhong@sina.com。

[中圖分類號]R575.5；R965

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)17-2330-04

(收稿日期：2015-11-28修回日期：2016-02-26)