慢性乙型肝炎病毒感染者外周血輔助性T淋巴細胞17和調節性T淋巴細胞的變化及二者平衡的研究

婁 鳴，游 晶，劉懷鄂，陳紅英，涂 琛，丁 潔，靳 智

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·論著·

慢性乙型肝炎病毒感染者外周血輔助性T淋巴細胞17和調節性T淋巴細胞的變化及二者平衡的研究

婁 鳴，游 晶，劉懷鄂，陳紅英，涂 琛，丁 潔，靳 智

650032云南省昆明市，昆明醫科大學第一附屬醫院感染科

【摘要】目的分析慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者外周血輔助性T淋巴細胞17(Th17)和調節性T淋巴細胞(Treg)的變化及Th17/Treg平衡狀態，并探討Th17/Treg平衡在慢性HBV感染疾病發展過程中的作用。方法選取2013年11月—2015年12月昆明醫科大學第一附屬醫院診治的慢性HBV感染者142例為研究對象，其中慢性無癥狀HBV(ASC)攜帶者23例(ASC組)、慢性乙型肝炎(CHB)患者51例(CHB組)、乙型肝炎肝硬化(LC)患者37例(LC組)、乙型肝炎相關性肝細胞癌(HCC)患者31例(HCC組)。同期選取本院體檢健康者26例為正常對照組。采用流式細胞術測定外周血Th17、Treg表達率，并計算Th17/Treg比值，采用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法測定患者血清HBV-DNA載量，采用全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)水平。結果CHB組、LC組、HCC組外周血Th17、Treg表達率均高于正常對照組和ASC組(P<0.05)；LC組外周血Th17表達率高于CHB組，HCC組外周血Th17表達率低于CHB組和LC組(P<0.05)；HCC組外周血Treg表達率高于CHB組和LC組(P<0.05)；HCC組外周血Th17/Treg比值低于正常對照組、CHB組、LC組(P<0.05)。CHB組、LC組、HCC組患者血清HBV-DNA載量均低于ASC組(P<0.05)。CHB組、LC組、HCC組患者ALT、AST、TBIL水平均高于正常對照組和ASC組(P<0.05)；LC組ALT、TBIL水平高于CHB組(P<0.05)；HCC組ALT水平低于CHB組和LC組，AST水平高于CHB組和LC組，TBIL水平低于LC組(P<0.05)。CHB組Th17表達率與ALT、AST和TBIL呈正相關，Th17/Treg比值與ALT、AST水平呈正相關(P<0.05)；LC組Th17表達率與ALT水平呈正相關，Treg表達率與ALT、AST水平呈正相關(P<0.05)；其余各指標間無直線相關關系(P>0.05)。結論Th17和Treg在慢性HBV感染相關肝臟疾病的發生、發展過程中發揮著重要的作用，Th17/Treg失衡可能與慢性乙型肝炎病程進展密切相關，為臨床進一步研究奠定了基礎。

【關鍵詞】乙型肝炎病毒；乙型肝炎，慢性；T淋巴細胞，輔助；T淋巴細胞,調節性

婁鳴，游晶，劉懷鄂，等.慢性乙型肝炎病毒感染者外周血輔助性T淋巴細胞17和調節性T淋巴細胞的變化及二者平衡的研究[J].中國全科醫學，2016，19(18)：2115-2120.[www.chinagp.net]

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全世界約有20億人感染過乙型肝炎病毒(HBV)，其中3.5～4.0億人轉變為慢性HBV攜帶者，每年有50～120萬人死于HBV相關肝硬化(LC)和肝癌[1]。目前，HBV持續感染的機制尚不完全清楚，但有研究表明，其與宿主的病毒特異性細胞免疫缺陷有關，這可能是慢性HBV感染者不能得到有效治療的一個重要原因[2]。HBV特異性的CD4+T淋巴細胞和CD8+T細胞在HBV感染中發揮了重要作用[3-4]。輔助性T淋巴細胞17(T helper cell 17,Th17)和調節性T淋巴細胞(T regulatory cell,Treg)是近年來新發現的兩個CD4+T細胞亞群，正常情況下，機體內的Th17/Treg處于相對穩定的免疫平衡狀態[5]。Th17/Treg失衡與HBV感染相關肝臟疾病的病情變化和臨床轉歸有關[6]。本研究分析慢性HBV感染者外周血Th17和Treg的變化及Th17/Treg平衡狀態，探討Th17/Treg平衡在慢性HBV感染疾病發展過程中的可能作用，為進一步了解HBV感染相關肝臟疾病的免疫學發病機制及 HBV感染慢性化、疾病進展的機制提供理論依據。

1資料與方法

1.1一般資料選取2013年11月—2015年12月昆明醫科大學第一附屬醫院診治的慢性HBV感染者142例為研究對象，其中慢性無癥狀HBV(chronic asymptomatic HBV carrier,ASC)攜帶者23例(ASC組)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者51例(CHB組)、乙型肝炎LC患者37例(LC組)、乙型肝炎相關性肝細胞癌(HBV-related hepatocellular carcinoma,HCC)患者31例(HCC組)。同期選取本院體檢健康者26例為正常對照組。納入標準：(1)患者發病前均未行抗病毒治療；(2)患者均符合中華醫學會肝臟疾病學會分會與感染病學分會2010年聯合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[1]和2009年制訂的原發性肝癌診斷標準[7]。排除標準：(1)其他肝炎病毒感染患者；(2)酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等非病毒性肝炎患者；(3)其他嚴重的全身性疾病患者。本研究已通過本院倫理委員會同意，研究對象均知情同意。5組研究對象性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而年齡比較，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

1.2研究方法

1.2.1標本采集用含肝素鈉的抗凝管采集研究對象外周靜脈血約5 ml，混勻，待用。

表1　5組一般資料比較

注：a為χ2值，ASC=慢性無癥狀乙型肝炎病毒，CHB=慢性乙型肝炎，LC=肝硬化，HCC=乙型肝炎相關性肝細胞癌

1.2.2外周血中Th17及Treg的培養及測定

1.2.2.1外周血細胞體外刺激培養將上述采集的含肝素鈉抗凝管中的外周靜脈血混勻，取300 μl加入容量為15 ml離心管中，取含10%胎牛血清的PRMI 1640培養基900 μl于上述離心管中，依次加入蛋白酶抑制劑(Protein Transport Inhibitor)0.8 μl、濃度為1 μg/ml的離子霉素(Ion)1.2 μl、濃度為50 ng/ml的佛波酯(PMA)1.2 μl,用巴氏吸管吹打混勻，將離心管中液體移入T25培養瓶中，將T25培養瓶移至溫度為37 ℃、濃度為5% CO2恒溫培養箱中培養10 h。試驗過程應嚴格按照無菌操作。

1.2.2.2流式細胞術測定外周血Th17、Treg表達率將培養后的外周血細胞移至2 ml EP管內，以3 000 r/min離心7 min(離心半徑10.5 cm)；棄上清液，保留沉淀，加入Human Foxp3 Buffer A(按10×BufferA：dH2O=1∶9配備)(稀釋1×)1 500 μl，充分混勻，避光保存20 min后以4 000 r/min離心7 min(離心半徑10.5 cm)；棄上清液，保留沉淀，加入(1×)磷酸鹽緩沖液(PBS)1 000 μl，混勻后以4 000 r/min離心7 min(離心半徑10.5 cm)；棄上清液，保留沉淀，加入Human Foxp3 Buffer C (按Buffer B：1×Bufer A=1∶50配備)500 μl，充分混勻，避光保存30 min后以4 000 r/min離心7 min(離心半徑10.5 cm)；棄上清液，保留沉淀，加入(1×)PBS 1 000 μl，混勻后以4 000 r/min離心7 min(離心半徑10.5 cm)；棄上清液，保留沉淀，再次加入(1×)PBS 1 000 μl，混勻后以4 000 r/min離心7 min(離心半徑10.5 cm)；棄上清液，保留沉淀，加入(1×)PBS 50 μl和Human Th17/Treg Phenotyping Cocktail 4 μl，充分混勻，避光保存40 min后加入(1×)PBS 500 μl，以4 000 r/min離心7 min(離心半徑10.5 cm)；棄上清液，保留沉淀，加入(1×)PBS 350 μl，混勻后移入流式細胞管中上機測定外周血Th17、Treg表達率，計算Th17/Treg比值。

1.2.3血清HBV-DNA載量測定采用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法測定患者血清HBV-DNA載量。RT-PCR檢測系統(FQD-33A型)及試劑均由深圳市匹基生物工程股份有限公司提供，操作過程嚴格按照說明書進行。最終將血清HBV-DNA載量進行對數轉換后進行比較。

1.2.4肝功能測定采用全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)水平，操作嚴格按照說明書進行。

2結果

2.15組外周血Th17、Treg表達率及Th17/Treg比值比較5組外周血Th17、Treg表達率及Th17/Treg比值比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。CHB組、LC組、HCC組外周血Th17、Treg表達率均高于正常對照組和ASC組，差異有統計學意義(P<0.05)；LC組外周血Th17表達率高于CHB組，HCC組外周血Th17表達率低于CHB組和LC組，差異有統計學意義(P<0.05)；HCC組外周血Treg表達率高于CHB組和LC組，差異有統計學意義(P<0.05)；HCC組外周血Th17/Treg比值低于正常對照組、CHB組、LC組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。2.24組患者血清HBV-DNA載量比較4組患者血清HBV-DNA載量比較，差異有統計學意義(P<0.05)。CHB組、LC組、HCC組患者血清HBV-DNA載量均低于ASC組，差異有統計學意義(P<0.05，見表3)。2.35組ALT、AST、TBIL水平比較5組ALT、AST、TBIL水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。CHB組、LC組、HCC組患者ALT、AST、TBIL水平均高于正常對照組和ASC組，差異有統計學意義(P<0.05)；正常對照組與ASC組ALT、AST、TBIL水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；LC組ALT、TBIL水平高于CHB組，差異有統計學意義(P<0.05)；HCC組ALT水平低于CHB組和LC組，AST水平高于CHB組和LC組，TBIL水平低于LC組，差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。

2.45組外周血Th17表達率、Treg表達率、Th17/Treg比值與ALT、AST、TBIL水平的相關性分析CHB組Th17表達率與ALT、AST和TBIL呈正相關，Th17/Treg比值與ALT、AST水平呈正相關(P<0.05)；LC組Th17表達率與ALT水平呈正相關，Treg表達率與ALT、AST水平呈正相關(P<0.05)。其余各指標間無直線相關關系(P>0.05，見表5)。

Table 2Comparison of the expression rates of Th17 and Treg and Th17/Treg among the 5 groups

組別例數Th17表達率(%)Treg表達率(%)Th17/Treg比值正常對照組261.6±0.61.2±0.51.7±1.0ASC組231.3±1.41.3±0.81.4±1.7CHB組513.5±1.4ab2.4±0.8ab1.6±1.0LC組374.4±1.7abc2.6±1.2ab2.1±1.3HCC組312.6±1.2abcd3.4±0.7abcd0.8±0.4acdF值27.93431.4036.074P值<0.001<0.001<0.001

注：Th17=輔助性T淋巴細胞17，Treg=調節性T淋巴細胞；與正常對照組比較，aP<0.05；與ASC組比較，bP<0.05；與CHB組比較，cP<0.05；與LC組比較，dP<0.05

表3　4組患者血清HBV-DNA載量比較

注：HBV=乙型肝炎病毒；與ASC組比較，aP<0.05；b為經對數轉換所得

表4　5組ALT、AST、TBIL水平比較

注：ALT=丙氨酸氨基轉移酶，AST=天冬氨酸氨基轉移酶，TBIL=總膽紅素；與正常對照組比較，aP<0.05；與ASC組比較，bP<0.05；與CHB組比較，cP<0.05；與LC組比較，dP<0.05

3討論

目前，關于HBV感染相關肝臟疾病的致病機制尚未完全闡明，但大多數研究認為，其與機體的免疫功能紊亂密切相關[7-9]。人體感染HBV后，機體自身免疫狀態是決定其轉歸的關鍵因素之一，大多數的慢性HBV感染患者是在自身的免疫缺陷、HBV基因突變逃避免疫清除等情況下形成的[10]。傳統研究認為，HBV感染相關肝臟疾病的免疫紊亂主要與CD4+T淋巴細胞Th1、Th2有關[11]。近年來研究發現，除了Th1、Th2外，另一對CD4+T細胞——Th17和Treg在HBV感染中也發揮重要的作用[12]。在正常人體內，Th17、Treg表達率相對較低，其分化受體內代謝環境的影響，但Th17/Treg保持相對穩定[13]。由Th17產生的特異性白介素(IL)-17A與機體的自身免疫性疾病、腫瘤、宿主的抗病原微生物反應密切相關，IL-17F主要與宿主黏膜免疫有關[14-15]。Treg能分泌IL-4、IL-10、轉化生長因子β(TGF-β)等多種細胞因子，主要介導免疫耐受，也與自身免疫性疾病、腫瘤、移植免疫等密切相關[16-17]。HBV感染后，在患者體內隨著病情進展，Th17與Treg也可能存在動態演變過程。

表55組受試者外周血Th17表達率、Treg表達率、Th17/Treg比值與ALT、AST、TBIL的相關性分析(r值)

Table 5Correlation analysis between the expression rates of Th17 and Treg and Th17/Treg and ALT,AST and TBIL in the subjects of the 5 groups

組別ALTASTTBIL正常對照組 Th17表達率0.2080.0630.058 Treg表達率0.2960.2400.143 Th17/Treg比值0.3350.0030.147ASC組 Th17表達率0.2350.1170.157 Treg表達率0.3400.0500.360 Th17/Treg比值0.1530.1550.016CHB組 Th17表達率0.634a0.596a0.345a Treg表達率0.1670.1530.232 Th17/Treg比值0.630a0.563a0.115LC組 Th17表達率0.332a0.2630.153 Treg表達率0.525a0.501a0.215 Th17/Treg比值0.2780.0810.157HCC組 Th17表達率0.0560.1440.174 Treg表達率0.2110.2320.095 Th17/Treg比值0.1040.0270.152

注：a表示P<0.05

本研究發現，CHB組、LC組、HCC組外周血Th17、Treg表達率均高于正常對照組和ASC組，LC組外周血Th17表達率高于CHB組，HCC組外周血Th17表達率低于CHB組和LC組，HCC組外周血Treg表達率高于CHB組和LC組，HCC組外周血Th17/Treg比值低于正常對照組、CHB組、LC組。以上結果說明感染HBV后，患者Th17和Treg可能均被激活，但激活程度不同，在病程進展過程中，Th17/Treg比值減小，提示可能是Treg的高度分化，抑制了機體對HBV的免疫清除，造成不可逆轉的肝臟損害。

慢性HBV感染的自然病程一般分為免疫耐受期、免疫清除期、低復制期和再活躍期。肝細胞病變主要取決于機體的免疫應答。免疫應答既可以導致肝細胞損傷，又可清除病毒，甚至可誘導病毒的變異。當機體處于免疫耐受狀態時，不發生免疫應答，多成為慢性無癥狀攜帶者。CHB的發生、發展與血清HBV-DNA載量、肝細胞功能及宿主的免疫狀態相關，HBV并不能直接損傷肝細胞，肝細胞的損傷主要是由機體的免疫應答引起。當進入免疫清除期時，機體的免疫應答一方面可以清除HBV，另一方面可以造成肝細胞的損傷，表現為肝功能指標(ALT、AST、TBIL)的升高而血清HBV-DNA載量下降[18]。本研究發現，CHB組血清HBV-DNA載量較ASC組下降，ALT、AST、TBIL水平較正常對照組、ASC組升高，本研究結果與鄒曉毅等[18]研究結果相似。

本研究還發現，CHB組Th17表達率與ALT、AST和TBIL呈正相關，Th17/Treg比值與ALT、AST水平呈正相關，LC組Th17表達率與ALT水平呈正相關，Treg表達率與ALT、AST水平呈正相關，提示Th17、Treg與肝功能相關。

LC的形成與肝星形細胞(hepatic stellatecell,HSC)密切相關，HSC在TGF-β的作用下能分泌多種細胞外基質(extracellular matrix,ECM)，ECM在肝臟內過度沉積使肝臟結構發生改變，出現肝纖維化、LC。Treg可以通過分泌TGF-β作用于HSC，刺激HSC分泌ECM[19-20]；同時Th17通過分泌IL-17作用于HSC表面的IL-17R，使HSC活化并分泌IL-6、IL-23等細胞因子促使TGF-β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達增加，抑制自然殺傷細胞對HSC的殺傷作用而增強其纖維化作用[21]。HBV感染與HCC的發生關系密切，現在認為，HBV可與肝細胞內的人染色體整合，整合后的肝細胞受到刺激后容易發生各種轉化。其中，HBV的X蛋白和截斷的前S2/S多肽作為增強子可反式激活各種細胞因子，促進已整合的肝細胞轉化，促進HCC的發生[22]。大部分HCC發生在HBV感染的晚期，尤以LC基礎上發生多見，通常伴有炎癥活動，但是也有少部分與HBV感染相關肝細胞癌患者并無LC的證據，甚至其肝功能可一直正常。

免疫反應引起的慢性炎癥與腫瘤發生發展過程密切相關。Th17可以通過分泌IL-17促進Th1分化和誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)活化，發揮抗腫瘤作用[23]；另一方面，Th17可以促進一些血管因子如CXCL1、CXCL5、IL-8的生成，對腫瘤的生長和轉移有促進作用[24]。目前，Th17在HCC中的作用尚不清楚，考慮到CHB組和LC組Th17表達率、Th17/Treg比值較HCC組高，推測患者由肝炎發展到LC，再由LC發展到HCC，可能是從一個由炎癥主導的過程發展到一個由免疫抑制主導的過程。

綜上所述，Th17和Treg在慢性HBV感染相關肝臟疾病的發生、發展過程中發揮著重要作用，Th17/Treg失衡可能與CHB病程進展密切相關，故Th17/Treg比值可作為檢測CHB病情的一個指標，同時調節Th17和Treg的平衡關系可能成為治療CHB、LC的一個新策略；Th17、Treg與CHB患者的HBV-DNA間并無相關性，說明Th17、Treg本身并不能影響HBV的復制。由于腫瘤發生發展的特殊性及復雜性，Th17、Treg與HCC間的相互關系目前尚不清楚，需更進一步的研究。

作者貢獻：婁鳴負責試驗實施和論文撰寫；游晶負責試驗設計和實施；陳紅英、涂琛、丁潔、靳智負責試驗實施、資料收集；劉懷鄂負責質量控制與論文結構完善及修改。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：李婷婷)

Changes of Peripheral Th17 and Treg and Th17/Treg Balance in Patients With Chronic Hepatitis B Virus Infection

LOUMing，YOUJing，LIUHuai-e,etal.

DepartmentofInfectiousDisease,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes of peripheral Th17 and Treg and Th17/Treg balance in patients with chronic hepatitis B virus(HBV)infection,and to explore the possible role in the development of chronic HBV infection.MethodsFrom November 2013 to December 2015,we enrolled 142 patients with chronic hepatitis B virus infection who received treatment in the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University.Among them，there were 23 patients with chronic asymptomatic HBV carrier(ASC group),51 patients with chronic hepatitis B(CHB group)，37 patients with HBV-related liver cirrhosis(LC group)，and 31 patients with HBV-related hepatocellular carcinoma(HCC group).In the same period，26 healthy people were enrolled in the hospital as normal control group.Flow cytometry was used to determine the expression rates of peripheral Th17 and Treg and Th17/Treg.RT-PCR was employed to determine HBV-DNA load,and fully automatic biochemical analyser was employed to detect ALT,AST and TBIL.ResultsCHB group,LC group and HCC group were higher than normal control group and ASC group in the expression rates of peripheral Th17 and Treg(P<0.05)；LC group was higher than CHB group in the expression rate of peripheral Th17，and HCC group was lower than CHB group and LC group in the expression rate of peripheral Th17(P<0.05)；HCC group was higher than CHB group and LC group in the expression rate of Treg(P<0.05)；HCC group was lower than normal control group，CHB group and LC group in peripheral Th17/Treg(P<0.05).CHB group,LC group and HCC group were lower than ASC group in serum HBV-DNA load(P<0.05).CHB group,LC group and HCC group were higher than normal control group and ASC group in the levels of ALT,AST and TBIL(P<0.05)；LC group was higher than CHB group in the levels of ALT and TBIL(P<0.05)；HCC group was lower in ALT level and higher in AST level than CHB group and LC group,and HCC group was lower than LC group in TBIL level(P<0.05).In CHB group,the expression rate of Th17 was positively correlated with the levels ALT，AST and TBIL，and Th17/Treg was positively correlated with the levels of ALT and AST(P<0.05)；in LC group,the expression rate of Th17 was positively correlated with ALT level,and the expression rate of Treg was positively correlated with the levels of ALT and AST(P<0.05)；there was no other linear correlation(P>0.05).ConclusionTh17 and Treg play an important role in the occurrence and development of chronic HBV infection related liver disease,and the imbalance of Th17/Treg may be closely correlated with the progress of chronic hepatitis B,which providesa basis for further clinical research.

【Key words】Hepatitis B virus；Hepatitis B,chronic；T-lymphocytes，helper;T-lymphocytes,regulatory

基金項目：云南省科技計劃項目(2011WS0053；2011FZ121；2012WS0028)；云南省教育廳基金項目(2013J053)

通信作者：游晶，650032 云南省昆明市，昆明醫科大學第一附屬醫院感染科；E-mail：jingyoukm@126.com

【中圖分類號】R 512.62

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.18.001

(收稿日期：2016-02-22；修回日期：2016-04-25)

·專題研究·

【編者按】乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染肝臟引起的對生命有潛在危害的疾病，是重要的全球健康問題。中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會發表聲明稱，我國已成為全球為乙型肝炎、肝硬化和肝癌付出最多社會成本的國家。全球3.5億的HBV攜帶者中我國有近1億，且在全球每年約70萬人的病毒性肝炎相關死亡人群中，我國占近50%。因此，不論是從急性傳染病角度還是從慢性肝臟疾病角度，HBV感染及其導致的慢性肝臟疾病及肝纖維化均是我國高度關注的問題。為此，本期特別邀請昆明醫科大學第一附屬醫院感染科主任游晶教授組織了關于HBV感染的相關肝臟疾病及抗病毒治療與T淋巴細胞免疫間關系的“專題研究”，以期為臨床關于乙型肝炎的研究與防治提供參考。