輔助性T淋巴細胞17/調節性T淋巴細胞平衡在乙型肝炎病毒感染相關肝臟疾病進展中的作用研究

劉懷鄂，游 晶，陳紅英，李鮮麗，陳 曉，蘭 青，張茹薏

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·論著·

輔助性T淋巴細胞17/調節性T淋巴細胞平衡在乙型肝炎病毒感染相關肝臟疾病進展中的作用研究

劉懷鄂，游 晶，陳紅英，李鮮麗，陳 曉，蘭 青，張茹薏

650032云南省昆明市，昆明醫科大學第一附屬醫院感染科(劉懷鄂，游晶，陳紅英，李鮮麗，蘭青，張茹薏)，腫瘤治療中心(陳曉)

【摘要】目的探討輔助性T淋巴細胞17(Th17)/調節性T淋巴細胞(Treg)平衡在乙型肝炎病毒(HBV)感染相關肝臟疾病進展中的作用。方法選取2011年1月—2015年6月昆明醫科大學第一附屬醫院收治的符合納入與排除標準的HBV感染者111例，并依據《實用傳染病學》中乙型肝炎輕、中、重度的診斷標準將患者分為A組23例(無癥狀慢性HBV攜帶者)、B組42例(輕中度慢性乙型肝炎患者)、C組18例(重度慢性乙型肝炎患者)和D組28例(乙型肝炎肝硬化患者)。同期選取本院體檢中心體檢健康者11例作為對照組。采用實時熒光定量系統測定HBV-DNA載量，采用流式細胞儀檢測外周血中Th17、Treg表達率，計算Th17/Treg比值。結果A、B、C、D組HBV-DNA載量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。5組受試者Treg表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；A組Th17表達率、Th17/Treg比值及B組Th17/Treg比值均低于對照組(P<0.05)；B、C、D組Th17表達率、Th17/Treg比值均高于A組(P<0.05)；C組Th17表達率、Th17/Treg比值均高于B組(P<0.05)。HBV感染者Th17表達率為2.7%(3.2%)，Treg表達率為1.0%(1.2%)，HBV-DNA載量為66.0×104(1 206.7×104)copies/ml。Th17表達率與Treg表達率呈正相關(rs=0.201，P=0.026)；HBV-DNA載量與Th17表達率(rs=0.137,P=0.257)、Treg表達率(rs=-0.019，P=0.878)、Th17/Treg比值(rs=0.120，P=0.324)無直線相關關系。結論慢性HBV感染者可能普遍存在Th17/Treg失衡，且Th17/Treg比值較單一的Th17、Treg表達率可能更能準確地反映HBV感染相關肝臟疾病的進展程度。

【關鍵詞】乙型肝炎病毒；乙型肝炎，慢性；T淋巴細胞，輔助；T淋巴細胞，調節性

劉懷鄂，游晶，陳紅英，等.輔助性T淋巴細胞17/調節性T淋巴細胞平衡在乙型肝炎病毒感染相關肝臟疾病進展中的作用研究[J].中國全科醫學，2016，19(18)：2121-2125.[www.chinagp.net]

Liu HE，You J，Chen HY，et al.Influence of the balance of Th17/Treg in the progress of hepatitis B virus related liver disease[J].Chinese General Practice，2016，19(18)：2121-2125.

乙型肝炎病毒(HBV)感染的慢性化和肝炎進展所導致的包括肝炎活動期、肝臟衰竭、肝硬化甚至肝癌的發生是困擾眾多HBV感染者及臨床醫生的主要問題[1]。有臨床研究顯示，HBV感染者的臨床結局與其機體免疫機制密切相關，尤其是T淋巴細胞，例如早期Th1/Th2細胞失衡學說[2]。但隨著具有促進肝臟炎性反應的輔助性T淋巴細胞17(Th17)和具有抑制肝臟炎性反應的調節性T淋巴細胞(Treg)被人們所認識，Th17與Treg在HBV感染的慢性化和肝炎進展過程中的作用逐漸受到臨床醫生的關注。而Th17與Treg在HBV感染過程中的作用如何，尤其是Th17/Treg細胞平衡在HBV感染中的意義逐漸成為HBV感染慢性化和肝炎進展機制研究中的重點內容。本研究通過比較HBV感染導致的不同程度肝臟疾病患者及健康對照者外周血中Th17、Treg表達率及Th17/Treg比值的變化情況，以了解Th17/Treg平衡在HBV感染相關肝臟疾病中的作用。

1對象與方法

1.1納入與排除標準納入標準：(1)符合2010版《慢性乙型肝炎防治指南》中慢性乙型肝炎的診斷標準[3]；(2)未經抗病毒治療。排除標準：(1)合并甲、丙、丁、戊型肝炎及免疫缺陷性疾病；(2)伴有肝癌、自身免疫性疾病、脂肪肝、酒精肝；(3)有吸毒史及毒物接觸史。

1.2研究對象選取2011年1月—2015年6月昆明醫科大學第一附屬醫院收治的符合納入與排除標準的HBV感染者111例，并依據《實用傳染病學》[4]中乙型肝炎輕、中、重度的診斷標準將患者分為A組23例(無癥狀慢性HBV攜帶者)、B組42例(輕中度慢性乙型肝炎患者)、C組18例(重度慢性乙型肝炎患者)和D組28例(乙型肝炎肝硬化患者)。同期選取本院體檢中心體檢健康者11例作為對照組。本研究經昆明醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，受試者均知情同意并簽署知情同意書。

本研究背景及創新點：

輔助性T淋巴細胞17(Th17)與調節性T淋巴細胞(Treg)在乙型肝炎病毒(HBV)感染相關肝臟疾病中的作用越來越受到醫學界的關注,但究竟Th17/Treg平衡在HBV感染慢性化及HBV相關肝臟疾病進展中的作用如何，目前尚不清楚。本研究通過比較健康人群、不同疾病進展程度的慢性乙型肝炎患者外周血中Th17、Treg表達率及Th17/Treg比值的差異和一系列相關性分析，證實了慢性HBV感染者可能普遍存在Th17/Treg失衡，Th17/Treg比值較單純的Th17、Treg表達率能夠更為準確地反映HBV感染相關肝臟疾病的進展程度。

1.3方法

1.3.1一般資料記錄受試者的性別、年齡、乙型肝炎家族史、HBV-DNA載量、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)；采用全自動生化分析儀奧林巴斯AU-5400及配套試劑檢測ALT水平，參考范圍0～40 U/L；按照上海科華生物工程股份有限公司HBV-DNA試劑盒說明書提取所有受試者DNA，裂解擴增后在實時熒光定量系統中測定HBV-DNA載量。

1.3.2Th17、Treg表達率檢測采集受試者清晨空腹靜脈血2～3 ml，置入EDTA抗凝管中，采用密度梯度離心法提取外周血單個核細胞(PBMC)備用。每1×106個細胞加入佛波酯(PMA，SIGMA公司)50 ng/ml、離子霉素(Ion，SIGMA公司)1 μg/ml，并在含高爾基蛋白轉換抑制劑的1640培養基中刺激5 h。以250×g離心5 min后，將重懸的細胞按流式細胞儀檢測試劑盒(BD公司)要求進行固定、染色、透化處理〔Th17采用白介素17(IL-17)細胞內染色，Treg細胞采用叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(Foxp3)細胞內染色〕，標記后的細胞采用流式細胞儀檢測，并采用Diva軟件分析Th17、Treg表達率，計算Th17/Treg比值。

2結果

2.15組受試者一般資料比較5組受試者性別、乙型肝炎家族史比較，差異無統計學意義(P>0.05)；A、B、C、D組HBV-DNA載量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；5組受試者年齡、ALT水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)。D組年齡高于對照組及A、B組，差異有統計學意義(P<0.05)；B、C、D組ALT水平均高于對照組和A組，差異有統計學意義(P<0.05)；C組ALT水平高于B組，差異有統計學意義(P<0.05)；D組ALT水平低于C組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

表1　5組受試者一般資料比較

注：-表示無此項；HBV=乙型肝炎病毒，ALT=丙氨酸氨基轉移酶；與對照組比較，aP<0.05；與A組比較，bP<0.05；與B組比較，cP<0.05；與C組比較，dP<0.05；e為χ2值，f為F值，余為H值

2.25組受試者Th17、Treg表達率及Th17/Treg比值比較5組受試者Th17表達率、Th17/Treg比值比較，差異有統計學意義(P<0.05)；5組受試者Treg表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。A組Th17表達率、Th17/Treg比值及B組Th17/Treg比值均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；B、C、D組Th17表達率、Th17/Treg比值均高于A組，差異有統計學意義(P<0.05)；C組Th17表達率、Th17/Treg比值均高于B組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

表25組受試者Th17、Treg表達率及Th17/Treg比值比較〔M(QR)〕

Table 2Comparison of the expression rates of Th17 and Treg and Th17/Treg among the five groups

組別例數Th17表達率(%)Treg表達率(%)Th17/Treg比值對照組113.6(3.9)0.6(1.6)5.5(4.8)A組231.0(1.5)a1.0(1.2)0.8(1.4)aB組422.9(3.8)b1.0(1.0)2.9(3.7)abC組183.9(4.3)bc1.1(1.0)4.0(4.2)bcD組283.3(3.4)b0.9(1.1)2.9(4.3)bH值31.1003.06128.250P值<0.0010.548<0.001

注：Th17=輔助性T淋巴細胞17，Treg=調節性T淋巴細胞；與對照組比較，aP<0.05；與A組比較，bP<0.05；與B組比較，cP<0.05

2.3相關性分析HBV感染者Th17表達率為2.7%(3.2%)，Treg表達率為1.0%(1.2%)，HBV-DNA載量為66.0×104(1 206.7×104)copies/ml。Th17表達率與Treg表達率呈正相關(rs=0.201，P=0.026)；HBV-DNA載量與Th17表達率(rs=0.137,P=0.257)、Treg表達率(rs=-0.019，P=0.878)、Th17/Treg比值(rs=0.120，P=0.324)無直線相關關系。

3討論

近年來，肝臟炎性反應在HBV清除、HBV感染相關性肝臟疾病進展中的作用受到越來越多的關注，一定程度上反映了肝臟炎性反應在肝炎-肝硬化-肝癌進程中的重要意義[5-6]。Franzese等[7]分析了慢性乙型肝炎患者和感染了HBV恢復后的患者外周血中的CD4+CD25+Treg在體外對CD8+T淋巴細胞的影響，發現去除CD4+CD25+Treg后PBMC中的CD8+T淋巴細胞的數量增加且功能增強，證實了CD4+CD25+Treg通過抑制CD8+T淋巴細胞而起到免疫調節作用。隨后的相關研究指出，Th17在HBV感染過程中會促進肝臟炎性反應[8-9]。國內外多數研究認為，Treg表達率的升高可以減輕肝臟炎性反應，同時與HBV感染的慢性化存在一定關系[10-12]。而Th17具有明顯的促進肝臟炎性反應的作用，Treg能夠抑制Th17發育[13]。但也有研究認為，單純的Treg表達率升高，肝臟Foxp3表達升高并不能完全抑制白介素(IL)-23/IL-17炎性通路[8]。Pyzik等[14]在研究中還發現Treg在IL-1、IL-23及IL-21的作用下可以轉變為Th17。Th17/Treg細胞失衡在HBV感染的相關肝臟疾病纖維化進展中可能發揮了促進作用，較高的Th17/Treg比值與肝臟纖維化呈正相關[15]。因此，Th17/Treg平衡在HBV感染慢性化及HBV相關肝臟疾病進展中的意義可能遠大于單獨的Treg表達率或Th17表達率的變化。

本研究結果顯示，D組年齡大于對照組及A、B組，提示年齡可能是HBV感染的肝臟疾病進展階段中的重要相關因素，尤其是肝硬化患者，隨其HBV感染時間越長，肝硬化的發生風險相應增大。A組Th17表達率低于對照組，B、C、D組Th17表達率均高于A組，C組Th17表達率高于B組，提示HBV感染的相關肝臟疾病中，Th17是調控肝臟炎性反應程度的主要細胞,肝臟疾病的嚴重程度與Th17表達率可能存在一定關系。但觀察健康者和無癥狀慢性HBV攜帶者的Th17表達率和ALT水平發現，其ALT水平與Th17表達率的高低并不完全一致，健康者Th17表達率明顯高于無癥狀慢性HBV攜帶者，但ALT水平卻并未見明顯升高，說明單純依靠Th17表達率無法推斷HBV感染肝臟疾病的進展程度，而較低水平的Th17可能是HBV感染慢性化的原因之一。本研究中雖然各組間Treg表達率并無差異，但Th17/Treg比值卻存在差異，且A、B組Th17/Treg比值均低于對照組，B、C、D組Th17/Treg比值均高于A組，C組Th17/Treg比值均高于B組，提示Th17/Treg比值并不是HBV感染后是否慢性化和相關肝臟疾病進展程度的唯一決定因素。本研究相關性分析結果顯示，Th17表達率與Treg表達率呈正相關，HBV-DNA載量與Th17表達率、Treg表達率、Th17/Treg比值無直線相關關系，表明Treg細胞在肝臟炎性反應的調控中起隱匿調控作用，而Th17/Treg比值更能夠準確地反映HBV感染相關肝臟疾病的進展程度。相關臨床研究顯示，慢性乙型肝炎患者Treg表達率較健康者明顯升高，且與HBV-DNA載量呈正相關[7，10-11]。但亦有研究結果顯示，慢性乙型肝炎患者Treg表達率與HBV-DNA載量無直線相關關系[16-17]，本研究結果與之一致。分析研究結果不一致的原因除了界定Treg的標志不一致外(部分研究采用CD4+CD25+界定Treg，部分研究采用CD4+CD25+Foxp3+來界定)，也可能與慢性乙型肝炎患者不同監測時間點的即時免疫狀態有關[18]。

綜上所述，Th17、Treg是調控HBV感染相關肝臟疾病的重要細胞，但單獨的Th17或Treg均不能完全反應HBV感染者的臨床結局或者與之相關的肝臟疾病進展程度；Th17/Treg比值較Th17或Treg能夠更準確地反映HBV感染相關肝臟疾病的進展程度；慢性HBV感染者可能普遍存在Th17/Treg失衡，但Th17/Treg失衡可能并不是導致HBV感染慢性化和相關肝臟疾病進展的唯一因素。

作者貢獻：劉懷鄂、游晶進行試驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；陳紅英、李鮮麗、陳曉、蘭青、張茹薏進行試驗實施、評估、資料收集；游晶進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

參考文獻

[1]Ganem D，Prince AM.Hepatitis B virus infection natural history and clinical consequences [J].N Engl J Med，2004，350(11)：1118-1129.

[2]Vierling JM.The immunology of hepatitis B[J].Clin Liver Dis，2007，11(4)：727-759.

[3]Chinese Society of Hepatology Chinese Society of Infectious Diseases,Chinese Medical Association.The guideline of prevention and treatment for chronic hepatitis B(2010 version)[J].Journal of Clinical Hepatology,2011，27(1)：I-XVI.(in Chinese)

中華醫學會肝病學分會,中華醫學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].臨床肝膽病雜志，2011，27(1)：I-XVI.

[4]李夢東,王宇明.實用傳染病學[M].3版.北京：人民衛生出版社，2005.

[5]Terrault NA,Bzowej NH,Chang KM,et al.AASLD guidelines for treatment of chronic hepatitis B[J].Hepatology,2016,63(1):261-283.

[6]Korean Association for the Study of the Liver(KASL).KASL clinical practice guidelines:management of chronic hepatitis B[J].Clin Mol Hepatol,2016,22(1):18-75.

[7]Franzese O，Kennedy PT，Gehring AJ，et al.Modulation of the CD8+T cell response by CD4+CD25+regulatory T cells in patients with hepatitis B virus infection [J].J Virol，2005，79(6)：3322-3328.

[8]Zhang JY，Zhang Z，Lin F，et al.Interleukin-17 producing CD4+T cells increase with severity of liver damage in patients with chronic hepatitis B [J].J hepatol，2010，51(1)：81-91.

[9]Zhang JY，Song CH，Shi F，et al.Decreased ratio of Treg cells to Th17 correlates with HBV DNA suppression in chronic hepatitis B patients undergoing entecavir treatment [J].PLoS One，2010，5(11)：e13869.

[10]Xu D，Fu J，Jin L，et al.Circulating and liver resident CD4+CD25+regulatory T cells actively influence the antiviral immune response and disease progression in patients with hepatitis B [J].J Immunol，2006，177(1)：739-747.

[11]Tian Y，Qiu ZF，Li TS.The difference and significance of peripheral blood regulatory T cells in patients with symptomatic chronic hepatitis B,asymptomatic HBV carriers and acute self-limiting HBV infection [J].Chinese Journal of Micrcbiology and Immunology，2007，27(9)：831-834.(in Chinese)

田瑛，邱志峰，李太生.慢性乙型肝炎患者HBV攜帶者及急性自限性HBV感染者外周血調節性T細胞的差異及意義[J].中華微生物和免疫學雜志，2007，27(9)：831-834.

[12]Lyu F，Gao YF，Cui MF，et al.Expression levels of CD4+CD25+regulatory T cells in peripheral blood mononuclear cells in patients whit chronic hepatitis B viral infection[J].Journal of Practical Hepatology，2010，13(1)：13-15.(in Chinese)

呂峰，郜玉峰，崔明芳，等.慢性HBV感染患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞表達及其臨床意義[J].實用肝臟病雜志，2010，13(1)：13-15.

[13]Li J,Shi J,Ren W,et al.Regulatory role of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells on IL-17 secreting T cells in chronic hepatitis B patients [J].Dig Dis Sci，2014，59(7)：1475-1483.

[14]Pyzik M,Piccirillo CA.TGF-beta1 modulates FOXP3 expression and regulatory activity in distinct CD4+T cell subsets [J].J Leukoc Biol,2007,82(2)：335-346.

[15]Li J,Qiu SJ,She WM,et al.Significance of the balance between regulatory T(Treg) and T helper 17(Th17) cells during hepatitis B virus related liver fibrosis[J].PLoS One,2012,7(6):e39307.

[16]Su ZJ，Yu XP，Guo RY，et al.Changes in the balance between Treg and Th17 cells in patients with chronic hepatitis B[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2013，76(4)：437-444.

[17]Peng G，Li S，Wu W，et al.Circulating CD4+CD25+regulatory T cells correlate with chronic hepatitis B infection [J].Immunology，2008，123(1)：57-65.

[18]Miyara M,Yoshioka Y,Kitoh A,et al.Functional delineation and differentiation dynamics of human CD4+T cells expressing the FoxP3 transcription factor [J].Immunity，2009，30(6)：899-911.

(本文編輯：毛亞敏)

Influence of the Balance of Th17/Treg in the Progress of Hepatitis B Virus Related Liver Disease

LIUHuai-e，YOUJing，CHENHong-ying，etal.

DepartmentofInfectiousDisease，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650032，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of the balance of Th17/Treg in the progress of hepatitis B virus(HBV) related liver disease.MethodsFrom January 2011 to June 2015,we enrolled 111 patients with HBV infection who accorded with inclusion and exclusion criteria from the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University.Base on the diagnostic standards of HBV in Practical Infectious Diseases,all the patients were divided into four groups:group A(23 patients with asymptomatic chronic HBV carriers),group B(42 patients with mild-moderate chronic hepatitis B patients),group C(18 patients with severe chronic hepatitis B) and group D(28 patients with hepatitis and hepatic cirrhosis),and we also enrolled 11 healthy people who received treatment in the physical examination center in the hospital in the same period as control group.Realtime fluorescent quantitative system was used to determine HBV-DNA load,and flow cytometry was employed to detect the expression rates of peripheral Th17 and Treg and Th17/Treg.ResultsGroup A，group B，group C，group D were not significantly different in the HBV-DNA load (P>0.05).The 5 groups were not significantly different in the expression rate of Treg (P>0.05);group A was lower than control group in the expression rate of Th17 and Th17/Treg,and group B was lower than control group in Th17/Treg (P<0.05);group B,group C and group D were higher than group A in the expression rate of Th17 and Th17/Treg (P<0.05);group C was higher than group B in the expression rate of Th17 and Th17/Treg (P<0.05).For the all patients with HBV infection,the expression rate of Th17 was 2.7%(3.2%),the expression rate of Treg was 1.0%(1.2%),and HBV-DNA load was 66.0 × 104(1 206.7 × 104) copies / ml.The expression rate of Th17 was positively correlated with the expression rate of Treg(rs=0.201，P=0.026);HBV-DNA load had no linear correlation with the expression rate of Th17(rs=0.137,P=0.257),the expression rate of Treg(rs=-0.019，P=0.878),and Th17/Treg(rs=0.120，P=0.324).ConclusionThe imbalance of Th17/Treg maybe a common phenomenon in patients with chronic HBV infection，and the ratio of Th17/Treg can more accurately reflect the progress of HBV infection-related liver disease than the expression rate of Th17 or Treg alone.

【Key words】Hepatitis B virus；Hepatitis B,chronic;T-lymphocytes,helper；T-lymphocytes,regulatory

基金項目:云南省科技廳應用基礎研究面上項目(2011FZ121)

通信作者：游晶，650032云南省昆明市，昆明醫科大學第一附屬醫院感染科；E-mail：jingyoukm@126.com

【中圖分類號】R 373.21

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.18.002

(收稿日期：2016-03-09；修回日期：2016-05-06)

·專題研究·