抗酸桿菌液基薄層涂片方法的臨床應用研究

賀　雄，楊栗坤，曹艷龍，孫雯娜，王心靜，程小星，王仲元

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抗酸桿菌液基薄層涂片方法的臨床應用研究

賀雄，楊栗坤，曹艷龍，孫雯娜，王心靜，程小星，王仲元

［摘要］目的 評價結核分枝桿菌液基薄層涂片法對不同類型標本的染色檢查效能。方法 對200份住院1周內結核病患者的標本同時進行液基薄層方法與直接涂片法鏡檢抗酸桿菌，其中包括148份晨痰標本，52份體液標本，比較2種方法的陽性檢出率。結果 排除16份重復標本，9份未進行分枝桿菌培養的標本，納入的123份痰標本中，液基薄層法陽性率33.33％，直接涂片法陽性率24.39％，差異有統計學意義（P=0.012）；培養陽性病例的痰標本中，液基薄層法陽性率58.82％，直接涂片法陽性率44.12％，差異有統計學意義（P=0.018）。52份體液標本中，液基薄層法陽性率13.46％，直接涂片陽性率1.96％，差異有統計學意義（P=0.041）；培養陽性病例的16份體液標本中，液基薄層法陽性比例為7/16，直接涂片法陽性比例為1/16， 差異有統計學意義（P=0.040）。結論 基于液基薄層方法的抗酸桿菌涂片陽性率高于直接涂片法，對于體液標本陽性率提高顯著，有利于臨床上快速診斷，但對于痰標本的應用須綜合考慮檢驗時長和檢驗費用。

［關鍵詞］分枝桿菌屬；結核；診斷；臨床實驗室技術

抗酸桿菌涂片顯微鏡檢查方法是最早的結核病實驗室檢驗手段，目前仍然是結核病檢驗方法學的基礎，具有快速、價廉的優勢，對判斷患者的傳染性具有重要意義，因此對它的研究和改進從未停歇過，目標是提高涂片鏡檢的陽性率。

基于液基薄層方法的抗酸桿菌涂片方法（抗酸桿菌液基薄層涂片方法）以較早應用于脫落細胞檢查的液基薄層細胞學方法為基礎，對標本進行解粘聯去雜質處理后離心制片。我們用臨床上不同部位來源的標本對此方法和臨床普遍應用的直接涂片方法做了對照研究。

1　材料與方法

1.1 材料 材料系解放軍第三○九醫院結核病臨床實驗室于2015年7月接收的結核科住院患者入院1周內的臨床檢測標本，患者臨床診斷均為“結核病”。分枝桿菌MGIT 960培養基和 培養分析儀購自美國BD公司。液基薄層試劑盒和消化液分別由湖南天騎公司和武漢瑞新昌生物公司提供。

1.2 方法 臨床送檢的“涂片找抗酸桿菌”的標本進行直接涂片后，剩余標本同時進行液基薄層涂片。直接涂片法按照《結核病實驗室檢驗規程》［1］進行標本涂片、染色、鏡檢和記錄結果。液基薄層涂片法分別按照湖南天騎和武漢瑞新昌生物公司提供的方法說明書進行。基本過程為：在專有標本瓶中進行標本的消化液處理，配套離心機內制備甩片、烘干、染色及鏡檢。分枝桿菌培養按照操作程序指南《BACTECTMMGITTM960 Mycobacterial Detection System》［2］進行標本的分枝桿菌培養，并記錄結果。

1.3 統計學處理 采用CHISS 2004軟件進行統計分析。2種方法相關性比較用四格表χ2檢驗/校正χ2檢驗/確切概率檢驗，2組率的比較采用配對四格表χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1 標本類型及納入數量 共檢測200份標本，其中包括148份晨痰標本，52份體液標本。排除16份重復標本和9份未進行分枝桿菌培養的標本，共納入123份痰標本和52份體液標本。標本類型和數量見表1。

表1　標本類型和數量Table 1 Types and numbers of clinical samples

2.2 痰標本的檢測結果 用2種方法對123份結核患者痰標本進行檢測，結果見表2。一致性分析結果表明2種方法具有相關性（P＜0.05）， 液基薄層法陽性率（33.33％）明顯高于直接涂片法陽性率（24.39％）（P＜0.05）。

表2　2種涂片方法檢測痰標本結果（例）Table 2 Results of detecting sputum samples by two smear methods （cases）

用2種方法對68份結核分枝桿菌痰培養陽性痰標本進行檢測，結果見表3。一致性分析結果表明2種方法具有相關性（P＜0.05）， 液基薄層法陽性率（58.82％）明顯高于直接涂片法陽性率（44.12％）。因為結核分枝桿菌痰培養陽性具有確診價值，所以液基薄層法靈敏度為58.82％，直接涂片法靈敏度為44.12％， 前者明顯高于后者（P＜0.05）。

表3　2種涂片方法檢測68例痰培養陽性痰標本結果（例）Table 3 Results of detecting 68 sputum samples with positive culture by two smear methods （cases）

2.3 體液標本的檢測結果 用2種方法對52份結核患者體液標本進行檢測，結果見表4。一致性分析結果表明2種方法無相關性（P＞0.05），液基薄層法陽性率（13.46％）明顯高于直接涂片法陽性率（1.96％）（P＜0.05）。

表4　2種方法檢測體液標本結果（例）Table 4 Results of detecting body fluid samples by two smear methods （cases）

用2種方法對16份結核分枝桿菌體液培養陽性體液標本進行檢測，結果見表5。一致性分析結果表明2種方法無相關性（P＞0.05）， 液基法薄層陽性比例為（7/16）明顯高于直接涂片法陽性比例（1/16）（P＜0.05）。

表5　2種涂片方法檢測16例體液培養陽性體液標本結果（例）Table 5 Results of detecting 16 body fluid samples with positive culture by two smear methods （cases）

3　討　　論

結核病實驗室檢查是發現傳染源的最主要手段，是結核病確診、治療方案選擇和療效考核的主要依據［3］。2015年我國結核病的發病數和死亡數均占乙類傳染病的第2位，結核病的控制依舊任重道遠［4］。目前，結核病實驗室檢查方法中的分枝桿菌培養仍是結核病診斷的“金標準”，而涂片鏡檢仍是臨床上最常使用的篩查方法。

目前臨床上廣泛使用的涂片鏡檢法是直接涂片法。涂片鏡檢簡單、快速且成本低，但靈敏性低。為提高此方法的靈敏性，研究者對它的各個細節進行了優化［5］。抗酸桿菌液基薄層涂片方法以液基薄層細胞學方法為基礎，對標本進行解粘聯去雜質處理后離心制片。目前國內有2種不同的薄層離心制片機，我們在正常進行臨床標本檢驗的同時，用這2種薄層離心制片機進行了涂片鏡檢。但其中的甩片機制備的涂片過薄（RXC-YJ-4880），經過2次檢測后，因涂片過薄，部分呈空白片，我們放棄了對此制片方法的比較研究。另一種（TD-12）薄層離心制片的涂片方法結果良好，痰標本和體液標本的檢測陽性率雖然與以往研究的報告有差異，但也均顯著高于直接涂片法［6-7］。

為比較液基薄層涂片方法的靈敏性，我們只選取了臨床上明確診斷為結核病，治療不足1周的患者標本，而且這些患者同時送檢了分枝桿菌培養，以分析比較此方法對培養陽性標本檢測的敏感度。對所有的痰標本，液基薄層法陽性率明顯高于直接涂片法陽性率；培養陽性病例的痰標本中，液基薄層法陽性率也高于直接涂片法陽性率，其結果均有統計學差異。52份體液標本中，液基薄層法陽性率明顯高于直接涂片陽性率；培養陽性病例的體液標本中，液基薄層法陽性比例也明顯高于直接涂片法陽性比例，差異均具有統計學意義。但液基薄層法對體液的檢測陽性率提高更為顯著。體液標本的常規涂片方法是先對標本進行離心沉淀處理，之后再采集沉淀物直接涂片。常規處理時，離心時間長，持續20～30 min。而且沉淀物主要是大量的纖維蛋白或者黏稠的膿液或者細胞碎片，在體液標本含菌量少的情況下，直接鏡檢的陽性率非常低。液基薄層法一方面對標本做前處理時液化了黏稠物質，裂解了上皮細胞，減少了干擾；另一方面液基薄層法的標本盒容量相對大，標本直接離心到鏡檢載玻片上，較大程度濃縮了標本中的細菌，所以液基薄層法能夠顯著提高體液標本的涂片陽性率。

液基薄層法須要進行標本前處理、離心等步驟，檢測耗時較長，作為結核病專科檢驗室，痰標本檢測量大，如果處理時間長，可能影響技術人員的閱片效率，而技術人員的閱片效率是影響涂片陽性率的重要因素，液基薄層法的成本支出也高于直接涂片法。但對于體液標本，抗酸桿菌液基薄層涂片方法的陽性率提高顯著，有利于臨床上快速診斷。因此，對于痰標本，是否應用液基法涂片，須要綜合考慮檢驗室標本量、人員配給和其他快速檢驗項目等因素。目前，結核分枝桿菌基因芯片技術及高通量的基因測序等技術已逐步在臨床實驗室應用，為結核病的診治帶來重大的發展和變化［8］。

【參考文獻】

［1］ 趙雁林，逄宇. 結核病實驗室檢驗規程［M］. 北京：人民衛生出版社，2015：18-24.

［2］ Becton， Dickinson and Company. BACTECTMMGITTM960 Mycobacterial Detection System［EB/OL］. ［2016-3-10］. http：//www.bd.com/ds/productCenter/MT-Bactec.asp.

［3］ 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會. 衛生部關于印發《結核病預防控制工作規范》的通知［EB/OL］. ［2016-03-10］. http：//www.moh.gov.cn/mohbgt/pw10712/200804/19014.shtml.

［4］ 王永怡，王姝，張云輝，等. 2015年全球傳染病相關熱點回顧［J］. 傳染病信息，2016，29（1）：30-34.

［5］ Molicotti P， Bua A， Zanetti S. Cost-effectiveness in the diagnosis of tuberculosis： choices in developing countries［J］. J Infect Dev Ctries， 2014， 8（1）：24-38.

［6］ 梁湘暉，宋婕，劉文恩. 液基集菌制片技術檢測抗酸桿菌的臨床應用研究［J］.中國防癆雜志，2009，31（2）：86-89.

［7］ 成燦. 液基夾層法檢測灌洗液穿刺液中結核桿菌的臨床應用［J］. 中國現代醫學雜志，2012，22（32）：83-85.

［8］ 王心靜，王仲元.結核病實驗室診斷新技術的臨床應用［J］.傳染病信息，2014，27（3）：373-376.

（2016-03-16 收稿 2016-05-11 修回）

（責任編委 曲 芬 本文編輯 盧福昱）

［文獻標志碼］［中國圖書資料分類號］ R378.91 A

［文章編號］1007-8134（2016）00-0153-03

DOI：10.3969/j.issn.1007-8134.2016.03.007

*Corresponding author， E-mail： xinjing15@163.com

［基金項目 ］國家自然科學基金面上項目（81071319）；國家“十二五”科技重大專項（2013ZX10003006-003）

［作者單位］100091 北京，解放軍第三○九醫院結核病研究所（賀雄、楊栗坤、曹艷龍、孫雯娜、王心靜、程小星、王仲元）

［通訊作者 ］王心靜，E-mail∶ xinjing15@163.com

Clinical application of acid-fast bacilli smear method based on liquid-based cytology

HE Xiong， YANG Li-kun， CAO Yan-long， SUN Wen-na， WANG Xin-jing*， CHENG Xiao-xing， WANG Zhong-yuan
Institute of Tuberculosis， 309 Hospital of PLA， Beijing 100091， China

［Abstract］Objective To evaluate the diagnostic performance of smear method based on liquid-based cytology in detecting acid-fast bacilli in clinical specimens of different types. Methods A total of 200 samples including 148 samples of morning sputum and 52 samples of body fluid， which were collected from patients within one week since they were hospitalized， were examined for acid-fast bacilli by direct smear method and liquid-based smear method at the same time. The positive rates of the two methods were compared. Results Sixteen repeated samples and 9 samples without being cultured for acid-fast bacilli were excluded， so 123 samples of morning sputum and 52 samples of body fluid were included. As for 123 sputum samples， the positive rates were 33.33％ for liquid-based smear method and 24.39％ for direct smear method， and the difference was significant （P=0.012）； the positive rates were 58.82％ for liquid-based smear method and 44.12％ for direct smear method in culture-confirmed sputum samples， and the difference was significant （P=0.018）. As for 52 samples of body fluid， the positive rates were 13.46％ for liquid-based smear method and 1.96％ for direct smear method， and the difference was significant （P=0.041）； 7 samples were positive for liquid-based smear method and 1 for direct smear method in culture-confirmed sputum samples （16 samples）， and the difference was significant （P=0.040）. Conclusions The positive rate of detecting acid-fast bacilli by liquid-based smear method is higher than that by direct smear method， especially for body fluid specimens. The liquid-based smear method is useful for clinical rapid diagnosis. However， for the sputum specimens， the examination time and the cost should be considered.

［Key words］Mycobacterium； tuberculosis； diagnosis； clinical laboratory techniques