西瓜食酸菌CusB蛋白的生物信息學分析

劉星++胡金鳳++王希東

摘要：為了解西瓜食酸菌耐藥結節細胞分化（RND）家族外排轉運體中膜融合蛋白CusB生物信息學信息，利用相關軟件對西瓜食酸菌和其他革蘭氏陰性細菌的CusB蛋白進行理化性質分析，同時對西瓜食酸菌CusB蛋白的疏水性、跨膜結構域、磷酸化位點、信號肽及分泌蛋白亞細胞定位、蛋白質二級結構進行預測。結果表明：西瓜食酸菌CusB蛋白理化性質及進化樹分析結果與大腸桿菌較為接近，梨火疫病菌、熒光假單胞菌與其他5種細菌遺傳距離較遠，預測西瓜食酸菌CusB蛋白有1個區域疏水性較高，存在1個近N端的跨膜結構域，且還有多個磷酸化位點，前1～36個氨基酸殘基組成了信號肽，分泌蛋白位于周質空間，二級結構含有較多的α-螺旋、無規則卷曲。對CusB蛋白進行生物信息學分析，既豐富了信息學信息，又有助于在其分子水平的研究，同時也為西瓜食酸菌的抗銅性機理研究提供了依據。

關鍵詞：瓜類細菌性果斑病；西瓜食酸菌；RND外排轉運體；CusB蛋白；生物信息學分析

中圖分類號： S182文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0034-04

瓜類細菌性果斑病（bacterial fruit bloteh，BFB）是一種嚴重危害葫蘆科植物的世界性種傳細菌性病害，其病原菌為西瓜食酸菌（Acidovorax citrulli）[1]。自從1965年在美國首次發現西瓜食酸菌以來，世界多國已相繼報道該病害的發生[2]。目前在我國主要分布于新疆、內蒙古、山東、陜西、河北、福建、云南、吉林、海南、黑龍江、遼寧、臺灣等15個省（市）的西甜瓜種植區[3]，該病害嚴重影響了葫蘆科植物的產量和商品銷量，是我國葫蘆科作物產業的主要危害因子[4]。

由于西瓜食酸菌屬于革蘭氏陰性菌，因此其細胞質膜由細胞外膜、周質空間、細胞內膜構成[5]，并且其細胞膜上存在著革蘭氏陰性細菌特有的耐藥結節細胞分化（RND）外排轉運體[6]，該轉運體由3個部分構成：外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）、內膜蛋白（inner membrane efflux proteins，IMP）、膜融合蛋白（membrane fusion proteins，MFP），主要負責細菌細胞內重金屬離子、色素分子、糖類、抗生素等由胞內向胞外的轉運[7]。已有報道指出，大腸桿菌（Escherichia coli）中編碼CusB蛋白的基因突變會導致銅離子、銀離子無法正常轉運至胞外，最終導致大腸桿菌死亡[8]。在銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中RND外排轉運體任一組分缺失都會影響外排轉運體的正常工作[9]。目前，在西瓜食酸菌中還未見關于RND外排轉運體中膜融合蛋白的報道。本研究運用生物信息學分析的方法，對A.citrulli的膜融合蛋白基因cusB基因和CusB蛋白的理化性質、進化分析、疏水性、跨膜結構域、磷酸化、信號肽、分泌蛋白亞細胞定位和蛋白質二級、三級結構進行了預測分析，以期為瓜類細菌性果斑病菌的抗銅分子機理的研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1數據來源本研究所用的西瓜食酸菌膜融合蛋白的氨基酸序列為筆者所在實驗室測序獲得的膜融合蛋白序列，在本試驗中命名為CusB。選擇梨火疫病菌（Erwinia amylovory，NC_005246）、茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum，NC_001399）、大腸桿菌（Escherichia coli，NC_007779）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，NC_022361）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens，NC_012674）、地毯草黃單胞菌柑橘致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. citri，NC_005240）中編碼膜融合蛋白的基因進行研究。

1.1.2相關軟件和在線工具本研究中所用相關軟件和在線工具主要有：ClustalX、MEGA 4.0、ProtParam、DNAMAN、

NETPHOBAC（www.cbs.dtu/）、SignalP、TargetP、TatP1.0、PSIPREDv3.0（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/）、SWISS-MODEL。

1.2試驗方法

1.2.1cusB基因基本信息登陸NCBI網站，搜索西瓜食酸菌全基因組序列同源的膜融合蛋白基因Aave_4663，了解該基因的基本信息。

1.2.2西瓜食酸菌及其他常見病原菌膜融合蛋白的理化性質比較利用分析軟件ProtParam對以上細菌膜融合蛋白CusB的理化性質進行分析。

1.2.3西瓜食酸菌與其他常見病菌膜融合蛋白氨基酸序列比對及系統發育樹構建以上述菌株為待測材料，對膜融合蛋白序列進行聚類分析，以CusB蛋白為標記，進行A.citrulli的CusB系統進化分析。蛋白質序列比對使用Clustal X方法[10]，系統發育分析使用MEGA4[11]。采用鄰接法，自展 1 000 次以評估樹的可靠性。

1.2.4CusB蛋白疏水性、跨膜結構域及磷酸化位點預測利用在線分析軟件ProtScale（www.expasy.org/）對西瓜食酸菌CusB蛋白進行疏水性分析；利用TMHMM軟件對西瓜食酸菌CusB蛋白跨膜結構域進行分析；利用在線軟件NETPHOBAC（www.cbs.dtu/）分析CusB蛋白磷酸化。

1.2.5CusB序列信號肽預測及蛋白質亞細胞定位利用SignalP、TargetP預測西瓜食酸菌CusB序列信號肽與蛋白質到達的亞細胞位點。

1.2.6CusB蛋白二級結構、三級結構的預測利用在線軟件PSIPREDv3.0（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/）對西瓜食酸菌CusB蛋白二級結構進行預測，利用在線軟件SWISS-Model（http：//swissmodel.expasy.org/）對其進行三級結構預測。

2結果與分析

2.1西瓜食酸菌cusB基因的基本信息

測序發現，西瓜食酸菌cusB基因長度為1 185 bp，編碼394個氨基酸序列。通過登陸NCBI網站，對西瓜食酸菌Aave_4663基因進行查閱發現：在UniProt中對膜融合蛋白的解釋為轉運體。其功能包含吖啶黃抗性、重金屬外排和多藥抗性蛋白，大多數該家族蛋白存在于革蘭氏陰性菌中，其膜融合蛋白使內膜蛋白和外膜蛋白結合在一起，形成一種轉運通道，使得胞內物質運輸到胞外。

2.2西瓜食酸菌及其他革蘭氏陰性菌膜融合蛋白的理化性質比較

用在線軟件ProtParam（http：//web.expasy.org/）分析包含西瓜食酸菌在內的7種病菌膜融合蛋白的氨基酸序列，詳見表1。由該蛋白氨基酸序列可知，分子式為C174 1H290 3N555O556S5，相對分子量為40.666 8 ku，具有394個氨基酸殘基，含量較多的有丙氨酸（A，20.8%）、纈氨酸（V，9.9%）、亮氨酸（L，8.9%），含量較少的有半胱氨酸（C，0.3%）、色氨酸（W，0.5%）、酪氨酸（Y，0.5%），pI值為10.58，不含有以終止密碼編碼的吡咯賴氨酸（Pyl）、硒半胱氨酸（Sec），半衰期在哺乳動物網織紅細胞離體培養為30 h，在酵母菌體內培養大于20 h，大腸桿菌內大于10 h，脂溶系數90.10，不穩定系數30.16，說明該蛋白穩定且耐熱。由表1可知，7種細菌的膜融合蛋白氨基酸殘基數在350～400個之間，其中西瓜食酸菌的膜融合蛋白殘基數位于第2，與梨火疫病菌、大腸桿菌的膜融合蛋白氨基酸殘基數較為接近，與地毯草黃單胞菌柑橘致病變種氨基酸殘基數相差較大。在相對分子量上，西瓜食酸菌排第3，茄科雷爾氏菌、銅綠假單胞菌較為接近，熒光假單胞菌分子量最低。

西瓜食酸菌的膜融合蛋白中酸性氨基酸的數量少于堿性氨基酸，理論等電點偏堿性，大部分理化性質與大腸桿菌相似。西瓜食酸菌不穩定系數較低，說明穩定性較好。2.3西瓜食酸菌及其他常見病菌膜融合蛋白氨基酸序列比對及系統發育樹構建

Clustal X軟件分析蛋白質一級序列見圖1。比對7種細菌CusB蛋白的氨基酸序列后用MEGA 4.0建立進化樹，結果見圖2，可見西瓜食酸菌與大腸桿菌聚類分析結果落在同一分支上，而與梨火疫病菌、熒光假單胞菌距離較遠。由此可知：序列比對和進化樹構建分析證實了CusB蛋白是1個RND外排轉運體的膜融合蛋白亞基。系統進化分析發現：西瓜食酸菌的CusB蛋白也與銅綠假單胞菌的膜融合蛋白和地毯草黃單胞菌柑橘致病變種及茄科雷爾氏菌屬于同類蛋白質。

2.4西瓜食酸菌CusB蛋白疏水性、跨膜結構域及磷酸化位點預測

維持蛋白質三級結構最重要的作用力就是疏水相互作用，在天然蛋白質中，疏水鍵是疏水側鏈為了避開水相而群聚在一起的一種相互作用。疏水作用對蛋白質的穩定性、構象、功能具有重要意義。利用PROTSCALE軟件對西瓜食酸菌的CusB蛋白進行疏水性分析，圖3結果表明，前30個氨基酸疏水性比較高。跨膜結構域通常由20個左右的疏水性氨基酸殘基組成，主要形成α-螺旋。利用TNHMM軟件對西瓜食酸菌CusB蛋白分析表明，該蛋白存在1段從第9至第31個氨基酸殘基組成的跨膜結構區，定位于細胞質膜上，這與疏水性分析結果一致（圖4）。利用軟件NETPHOSBAC1.0對西瓜食酸菌CusB蛋白進行磷酸化位點預測分析可知：在氨基酸全序列中，共有17個磷酸化位點。

2.5西瓜食酸菌CusB序列信號肽預測及蛋白質到達的亞細胞位點

利用SignalP-NN、SignalP-HMM對西瓜食酸菌CusB序列信號肽進行預測。結果表明：西瓜食酸菌CusB序列存在信號肽序列，其大小為1～36 bp；經過圖5的TargetP分析可知，信號肽類型為信號肽酶I（SPI），其所分泌的蛋白質所到達的亞細胞位點為S（即分泌到周質空間）。

2.6西瓜食酸菌CusB蛋白二級、三級結構預測

利用在線軟件PSIPREDv3.0（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/）對西瓜食酸菌CusB蛋白二級結構進行預測，通過不同的算法[蛋白質二級結構分類判別預測（OSC）、多變量線性回歸組合預測（MLRC）、神經網絡預測（PHD）、綜合預測（Sec·Cons）]計算α-螺旋、β-折疊、無規則卷曲各自占比得出更確切的參考值。由表2可知，CusB蛋白是α-螺旋、β-折疊、無規則卷曲同時存在的一種蛋白，且α-螺旋和無規則卷曲含量較多。利用Swiss-Model對西瓜食酸菌的cusB基因編碼蛋白質的三級結構進行同源建模，結果表明：CusB蛋白質的三維結構以無規則卷曲為主要結構元件，α-螺旋集中在一側，延伸鏈貫穿整條肽鏈（圖6）。

3討論與結論

RND外排轉運體是革蘭氏陰性菌細胞膜上所特有的一類轉運體，其中CusB蛋白是關鍵組分之一。西瓜食酸菌中的RND外排轉運體主要成分與大腸桿菌一樣，包括CusA、CusB、CusC 3個部分。

本研究主要對西瓜食酸菌的CusB蛋白進行生物信息學分析，結果發現：西瓜食酸菌cusB基因由1 185 bp核苷酸組成，翻譯產物為394個氨基酸殘基；CusB蛋白位于周質空間內，起著連接外膜蛋白和內膜蛋白并穩定RND外排轉運體以及運輸物質的作用。CusB蛋白的理化性質與大腸桿菌相似，由進化樹分析可知：西瓜食酸菌與大腸桿菌CusB蛋白為同一類蛋白，而梨火疫病菌、熒光假單胞菌與其他細菌遺傳距離較遠，同屬假單胞菌屬的銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌在CusB蛋白進化上也存在明顯差異，這說明由1個蛋白或基因來判定二者的進化關系是不精準的。蛋白質磷酸化是調節和控制蛋白質活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制，一般發生在翻譯后修飾，同時也是原核生物最重要的調控修飾之一，由于氨基酸側鏈加入了1個帶強負電荷的磷酸基團，發生酯化作用，從而改變了蛋白質的構象、活性、與其他分子相互作用的能力，CusB蛋白存在多個磷酸化位點，這可能與膜融合蛋白通過改變自身構象來轉運重金屬離子并轉運至外膜蛋白有關，也可能與細胞信號轉導有關，磷酸化在該蛋白上的具體功能還有待進一步驗證。

信號肽在蛋白質分泌過程中起著重要的作用，一般由 10～60個氨基酸殘基組成，通過在線軟件分析預測可知：該蛋白存在1段大小為1～36個氨基酸殘基組成的信號肽序列，并且信號肽分泌蛋白亞細胞器分布表明：分泌蛋白的分泌途徑所到達的位點為S型，即分泌在周質空間占88.6%；M型途徑，即定位于線粒體中占43.7%，未確定型占0.3%。S型所占比例較大，這再次體現了Ma在研究茄科雷爾氏菌時發現的革蘭氏陰性菌分泌蛋白通常位于周質空間和質膜外的結論[12]。西瓜食酸菌CusB蛋白的疏水性預測與跨膜結構域預測結果一致，在多肽鏈上近N端存在疏水性較高的部位及相應的跨膜結構域。目前，對于大腸桿菌的Cus系統研究比較深入，有報道指出，cus基因的突變會降低大腸桿菌對于銅離子、銀離子的外排[13]，因此對西瓜食酸菌的CusB蛋白進行生物信息學的分析能夠為分子水平的研究提供依據，對于揭示西瓜食酸菌的抗銅機理以及新型藥物的研發有重要意義。

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