細胞周期蛋白家族基因在家蠶幼蟲蛻皮過程中的表達

劉麗華++沈衛德++李兵

摘要：細胞周期蛋白（cyclin）是調控真核生物細胞有絲分裂的重要蛋白。以家蠶1～5齡幼蟲的眠蠶和起蠶為材料，采用實時熒光定量PCR方法對家蠶cyclin家族基因（CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE）在不同齡期幼蟲蛻皮過程中的表達進行研究。結果顯示，1齡幼蟲在眠期、起蠶期幾乎均檢測不到CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的表達，表明此時幼蟲器官發育基本完成，細胞分裂遲緩。在起蠶期，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達量均隨著幼蟲的發育進程逐漸增加，表明細胞分裂過程加劇，促進家蠶個體的不斷生長；眠期則沒有規律性變化。在2～5齡幼蟲中，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達量均為起蠶期高于眠期，眠期最重要的生理過程是細胞凋亡，因此眠期細胞周期蛋白家族基因表達水平較低，而CyclinB3基因在整個幼蟲時期幾乎不表達。本試驗結果為細胞周期蛋白在家蠶蛻皮變態發育過程中的調控機制研究提供了參考。

關鍵詞：家蠶；細胞周期蛋白；家族基因；幼蟲；表達譜

中圖分類號： Q786文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0045-02

細胞周期主要受細胞周期蛋白（Cyclin）、細胞周期蛋白依賴激酶（cyclindependent kinase，CDK）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）在G1/S期和G2/M期2個限制點的調控[1]。其中，CDK是真核生物細胞周期調控的關鍵因子，依賴Cyclin發揮其功能。Cyclin 的表達具有典型的周期性和時相特異性，可作為調節亞基與相應的CDK形成復合物，并正調節CDK的活性。不同Cyclin在不同時相可通過相應的CDK促進完成細胞周期[2]。

Cyclin廣泛存在于多種生物體內[3-4]，在哺乳動物細胞中已發現20多種細胞周期蛋白家族成員[5]，在家蠶體內已發現6種。CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1、CyclinH 均是家蠶細胞完成細胞周期必不可少的。有研究表明，CyclinA在S期、G2期到M期的轉變過程中發揮作用[6]；CyclinB 和CyclinB3同屬于B型周期蛋白，是M期的限制因素[7]；CyclinE是G1期向S期轉變中最重要的周期蛋白[8]；CyclinL1、H可能對細胞周期起調控作用[9-10]。

家蠶屬于完全變態發育昆蟲，一生要經過卵、幼蟲、蛹、成蟲4個形態和機能完全不同的發育階段[11]。幼蟲是攝取營養、快速生長的發育階段，幼蟲期每個齡期之間都要經歷眠期和蛻皮的過程，不同發育階段的細胞均要進行重組和分化，此過程必然受到Cyclin的調控。采用RT-PCR方法，在家蠶 1～5齡眠蠶和起蠶不同發育時期，研究直接影響細胞增殖分化的家蠶Cyclin家族基因（CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE）在蠶體的轉錄特征。本試驗結論為Cyclin在家蠶蛻皮變態發育過程中的調控機制研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1家蠶供試家蠶品種為大造，由蘇州大學蠶桑實驗室保存，于（25±1） ℃、相對濕度60%～75%條件下，用新鮮桑葉飼育。分別取家蠶1～5齡眠蠶、起蠶各10頭，雌雄各半，凍存于液氮中備用。

1.1.2主要試劑總RNA抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，M-MLV反轉錄試劑盒、SYBR PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒、其他化學試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2方法

1.2.1家蠶總RNA提取及cDNA制備按照Trizol試劑盒說明書分別提取家蠶1～5齡眠蠶、起蠶的總RNA，采用紫外分光光度計測定其純度和質量濃度。采用M-MLV反轉錄試劑盒將提取的1～5齡眠蠶、起蠶總RNA分別反轉錄為cDNA。

1.2.2實時熒光定量PCR按照Real-Time PCR的要求，采用Primer 5.0軟件設計Actin3內參基因及CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的引物（表1）。以合成的cDNA為模板，采用SYBR PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒對各基因進行實時熒光定量PCR擴增，具體步驟按照試劑盒說明書進行。反應體系為20 μL，反應程序為：95 ℃變性1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 31 s，40個循環。反應過程由ABI 7300型測定儀軟件自動設定，每個樣品重復3次。

1.2.3標準曲線的制作分別將CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、Actin3基因以10倍梯度稀釋為6個質量濃度梯度，進行Real-TimePCR。以所得循環閾值（CT值）為縱軸，以表1檢測基因與內參基因的引物

1.2.4數據處理采用ABI 7300型儀器自帶的Sequence Detection Software Version 1.3.1軟件處理RT-PCR的結果數據，并參照Schefe的方法[12]進行效率校正。采用SPSS 16.0軟件制作圖表。

2結果與分析

2.1總RNA純度和質量濃度的測定

提取各組織總RNA的D260 nm/D280 nm比值均在1.8～2.0，表明所提取總RNA的純度較高，無基因組、蛋白質、其他雜質污染。所提取總RNA的質量濃度為1.1～2.8 μg/μL。

2.2Cyclin家族基因在家蠶幼蟲不同時期的表達

細胞周期蛋白家族基因在家蠶幼蟲各發育時期的表達情況見圖1。1齡幼蟲在眠期、起蠶期幾乎均檢測不到CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的表達。在起蠶期，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達量均隨著幼蟲的發育進程逐漸增加，4齡起蠶達到最大值，5齡時稍有下降；眠期則沒有規律性變化。在2～5齡，CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達量均為起蠶期高于眠期，而CyclinB3基因在整個幼蟲時期幾乎不表達。

3結論與討論

昆蟲蛻皮是復雜的生理生化過程。已有研究表明，昆蟲蛻皮、變態發育過程是在蛻皮激素與保幼激素的協同調控下，大量基因按照一定的時間、空間次序被誘導或抑制表達而實現的。從細胞周期蛋白家族基因表達的變化探討蛻皮過程，可促進昆蟲蛻皮分子機制的深入研究。

本研究結果顯示，家蠶幼蟲無論是眠蠶還是起蠶，CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因在1齡幼蟲幾乎均不表達。可見，家蠶由受精卵發育至1齡幼蟲時，幼蟲器官基本發育完成，因此細胞分裂遲緩，這與筆者前期試驗中Cyclin家族基因在家蠶胚胎期的表達結果相同。與起蠶期相比，CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因在眠期的表達量均較低。可能的原因為，眠期的主要生理活動是蛻去舊表皮、形成新表皮，此期維持生命活動所需的營養物質和能量主要由貯藏在脂肪體中的營養物質代謝產生；細胞凋亡是此期最重要的生理過程，因此Cyclin家族基因表達水平較低。在起蠶期，Cyclin家族基因（CyclinB3基因除外）表達水平隨著幼蟲齡期推進持續增加，表明細胞分裂過程加劇，促進家蠶個體不斷生長；至4齡起蠶達到小高峰，之后稍有下降，家蠶生殖器官在3齡末至4齡初迅速發育，從而進入成熟期[13]。筆者前期對Cyclin家族基因的定量研究表明，其在生殖細胞中均顯著表達[14]，這可能是導致CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表達量增加的原因。

CyclinB、CyclinB3基因是家蠶細胞周期M期的限制因素。在本試驗中，CyclinB3基因在眠期和起蠶期幾乎均不表達，表明CyclinB基因在幼蟲蛻皮過程中起主導作用，而CyclinB、CyclinB3基因對細胞周期調控作用的不同之處有待進一步研究。

參考文獻：

[1]詹啟敏，陳杰. 細胞周期與腫瘤轉化醫學[J]. 中國腫瘤臨床，2014，41（1）：1-7.

[2]Kirsch T，Nickel J，Sebald W. BMP-2 antagonists e-merge from alterations in the low-affinity binding epitope forreceptor[J]. EMBO，2000，19（12）：3314-3324.

[3]Evans T，Rosenthal E T，Youngblom J，et al. Cyclin：a protein specified bymaternal mRNA in seaurchin eggs that is destroyed ateach cleavage division[J]. Cell，1983，33（2）：389-396.

[4]Lewin B. Driving the cell：M phase kinase，its partners，and substrates[J]. Cell，1990，61（5）：743-752.

[5]韓世愈，王嬌. 細胞周期蛋白在惡性腫瘤中的表達及其在腫瘤治療中的作用[J]. 分子診斷與治療雜志，2013，5（5）：357-360.

[6]Shigeo H，Masamitsu Y. Kinase independent activty of Cdc2/CyclinA prevnts the S phase in the Drosophila cell cycle[J]. Genes Cells，1999，4：111-122.

[7]潘敏慧，洪開麗，陳向云，等. BmCyclin B和BmCyclin B3是家蠶細胞周期進程所必需的[J]. 中國科學：生命科學，2013，43（3）：240-246.

[8]劉麗華，沈衛德，李兵，等. siRNA-CyclinE對家蠶細胞增殖的影響[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2013，41（4）：21-25.

[9]范蘭芬，鐘楊生，林健榮. 家蠶細胞周期蛋白基因BmCcnl1的克隆及表達分析[J]. 昆蟲學報，2010，53（12）：1325-1332.

[10]江艷. BmCycH基因及其在家蠶中表達特性的研究[D]. 杭州：浙江理工大學，2010.

[11]中國農業科學院蠶業研究所.中國養蠶學[M]. 上海：上海科學出版社，1991：228-230.

[12]Schefe J H，Lehmann K E，Buschmann I R，et al. Quantitative real-time RT-PCR data analysis：current concepts and the novel “gene expressions C-T difference{”} formula[J]. Journal of Molecular Medicine-JMM，2006，84（11）：901-910.

[13]向仲懷，黃君霆，夏建國. 蠶絲生物學[D]. 北京：中國林業出版社，2005：12-14.

[14]劉麗華，沈衛德，李兵，等. 家蠶細胞周期蛋白家族基因在5齡幼蟲組織中的表達譜分析[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2012，40（11）：13-17.龔麗，李云霞. 一種新型ATP-依賴型ClpP家族蛋白水解酶PlclpP基因的克隆、表達和酶學特性[J]. 江蘇農業科學，2016，44（5）：47-50.