大花三色堇FPNI—PCR反應體系的優化

李婧++曾媛++龔勝

摘要：融合引物與巢式聚合酶鏈式反應（fusion primer and nested integrated PCR，FPNI-PCR）是一種分離并擴增已知序列旁未知序列的有效方法。以大花三色堇（Viola×wittrockiana Gams.）為材料，為提高FPNI-PCR產物特異性，增加條帶清晰度，降低非特異性條帶的干擾，對FPNI-PCR反應體系中第1輪的模板DNA濃度進行對比，優化了第3輪反應中引物濃度、Taq DNA 聚合酶濃度、緩沖液用量，篩選了第3輪特異性引物的退火溫度，進一步完善了FPNI-PCR反應體系。各因素優化比對試驗表明：FPNI-PCR第1輪反應體系應以稀釋后的DNA為模板，20 μL體系中，用量在4.5～10 ng。第3輪最優反應體系為：20 μL反應體系中，特異性引物濃度0.2 μmol/L，引物SP2濃度 0.75 μmol/L，Taq DNA酶用量1.0 U，dNTP用量2 μL，10×buffer（20 mmol/L，Mg2+ plus）用量2 μL，模板1 μL（第2輪反應稀釋100倍后取1 μL為模板），ddH2O補足。第3輪反應中，退火溫度為64 ℃或66 ℃時條帶最為清晰。

關鍵詞：大花三色堇；FPNI-PCR；體系優化

中圖分類號： Q785文獻標志碼： A[HK]

融合引物與巢式聚合酶鏈式反應（fusion primer and nested integrated PCR，FPNI-PCR）是一種基于熱不對稱交錯PCR （thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）技術原理的PCR方法[1]，主要是利用目標序列旁的已知序列設計3 個嵌套特異性引物，與給出的9個特殊設計的隨機簡并引物（arbitrary degenerate prime，AD）相結合，進行1次巢式反應，并在簡并引物的基礎上設計2個嵌套的特殊引物替換第1輪PCR所用隨機引物用于第2、3輪的擴增。FPNI-PCR中融合引物（fusion primer），即特殊設計的隨機簡并引物，由3′端的隨機寡核苷酸（arbitrary degenerate oligonucleotides）和5′端可設計特異引物的一段序列組成，該序列用以替換初次PCR所用簡并引物。經過熱不對稱循環后的產物含有特異引物結合位點，能有效降低產物稀釋后非特異性擴增的影響[2]。FPNI-PCR具有高效靈敏、產物特異性高、重復性好、能夠在較短的時間內獲得目標片段等優點，是擴增基因側翼序列特別是啟動子的有效方法[3]。

FPNI-PCR與TAIL-PCR技術類似，其反應產物的穩定性、可重復性明顯受到反應體系模板、引物、Taq DNA 聚合酶、Buffer以及3輪退火溫度等因素的影響[4]。在進行 FPNI-PCR 反應獲取未知序列時，有必要根據上述因素，對不同因素進行優化組合，以獲得最優的反應結果。

大花三色堇（Viola×wittrockiana Gams.）是重要的冬春季花卉，有著十分豐富的花色和花斑類型，是研究植物花斑形成的理想植物[5]。筆者所在實驗室先前的研究表明，二氫黃酮醇還原酶（dihydroflavonol reductase，DFR）和花青素合成酶 （anthocyanidin synthase，ANS）基因是三色堇花斑由無色轉向著色的關鍵性基因[6]。關于DFR和ANS的相關研究發現，其啟動子中含有的眾多調控元件，與花色素調控密切相關[7-9]。因而這2個基因的啟動子結構特點，可能是花斑位置形成的一個關鍵性因素，其啟動子的克隆，對于進一步研究三色堇色斑的形成具有十分重要的意義。FPNI-PCR技術是克隆啟動子序列的有效方法，而目前關于三色堇FPNI-PCR技術研究尚無相關報道，本研究以三色堇為材料，對其FPNI-PCR反應體系進行優化，為三色堇VwDFR和VwANS基因啟動子的克隆提供技術基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

大花三色堇品種“賓哥”，花色為黃底黑斑，栽培于海南大學園藝園林學院基地。

1.2方法

1.2.1模板DNA的提取

提取三色堇幼葉DNA，步驟參考尚嘯等的改良CTAB法[10]，僅核酸分離時改用加1/10體積的5 mol/L NaAc。提取的DNA用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，電泳結果通過凝膠成像儀（Dolophin- Doc，美國）拍照，利用紫外分光光度計測濃度。小管分裝-20 ℃保存。

1.2.2試驗中用到的引物包括FPNI-PCR反應體系中的第1輪、第2輪、第3輪的簡并引物、特殊引物（表1）[1]以及根據VwANS基因設計的特異引物（表2）。

1.2.3FPNI-PCR體系的優化（1）模板DNA濃度篩選。將提取的DNA稀釋100、200倍，然后將未稀釋的DNA和稀釋不同倍數的DNA作為第1輪PCR反應的模板，反應采用表1中的FP5、FP6、FP7、FP9這4條簡并引物，反應程序見表3，反應體系為20 μL，具體組分見參考文獻。

（2）FPNI-PCR反應退火溫度的梯度篩選。根據設計的特異性引物GSP3的TM值，對第3輪退火溫度進行梯度篩選，篩選溫度分別是62、64、66 ℃。

（3）引物、10×buffer（20 mmol/L，Mg2+ plus）、Taq DNA酶用量的對比。 PCR反應采用20 μL反應體系，分別對影響第3輪反應體系中的主要參數：引物、10×buffer（Mg2+ plus）、Taq DNA酶，設置不同的濃度梯度，具體參數值見表3。此外，每20 μL反應體系中均含有dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、特異性引物0.2 μmol/L，模板為第2輪反應產物稀釋100倍取1 μL，加ddH2O補足至20 μL。逐一優化每個參數值，優化時，其他參數值均采用表3所列反應參數的第一水平值，引物采用參考文獻中的FP5、FP6、FP7、FP9這4條簡并引物 （表1），反應程序見表4。

2結果與分析

2.1DNA的提取結果

以三色堇嫩葉為材料提取DNA，經紫外分光光度計檢測，濃度為（0.901±0.019）μg/L，D260 nm/D280 nm介于1.8～2.0之間，說明樣品DNA中雜質較少。0.8%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，點樣孔無滯留，條帶清晰明亮，無明顯拖尾現象，說明RNA等雜質去除較干凈。結果表明，采用改良CTAB法可以有效地提取三色堇幼葉的DNA[10]，對于后續PCR反應有利。

2.2DNA的濃度對FPNI-PCR的影響

模板DNA的用量對FPNI-PCR反應有著非常直觀的影響，過多或者過少都會造成產物的不穩定或者無法產生條帶。普通方法提取的DNA通常含有雜質，而雜質對PCR產物的影響是非常顯著的。為了獲得清晰條帶，降低非特異性擴增，本試驗以3個濃度的DNA為模板，利用FP5、FP7、FP9這3種簡并引物分別擴增，其他條件相同，結果如圖2所示。

以未稀釋DNA為模板，3輪擴增后均無清晰條帶（圖2）。將DNA模板分別稀釋100、200倍，隨著DNA稀釋倍數的增加，簡并引物FP5擴增出的條帶數量明顯增加，且條帶清晰度明顯提升；簡并引物FP9擴增的結果，100倍稀釋比200倍稀釋擴增條帶數量更多、條帶更加清晰（圖2）。同時，7號引物在多個模板濃度下皆無明顯條帶，說明利用FPNI-PCR進行擴增時，模板的稀釋倍數應配合不同的簡并引物進行篩選，以期降低雜質等對反應的影響，才能獲得更為清晰的條帶。

2.3退火溫度對擴增產物的影響

通過對5、7、9號引物擴增反應的第3輪擴增的退火溫度進行篩選，篩選溫度為62、64、66、68 ℃，結果見圖3。總體來看，64、66 ℃反應效果更好，但是不同引物反應的最佳退火溫度不同，如FP5引物64 ℃下擴增效果較好，FP9號中超過700 bp 的條帶，在66 ℃下更清晰。

2.4Taq酶的用量對FPNI-PCR的影響

Taq酶在PCR反應體系中用量少，卻極為重要，Taq酶的類型、用量，甚至是生產商，都會對PCR產物造成明顯的影響。在本研究中，分別對以FP6和FP7簡并引物擴增獲得的PCR產物進行Taq酶的優化，其他條件全部相同，結果如圖4所示。試驗發現，Taq酶的用量對反應條帶的數量和清晰度都有一定影響，隨著Taq酶用量的增加，FP6和FP7擴增的PCR產物的量均有所提高，但FP6更為明顯，能獲得較為清晰的條帶，而FP7無明顯的清晰條帶。以簡并引物FP6擴增，Taq酶用量1.5 U時比1.0 U時條帶亮度只略有提升，且非特異性擴增也更為明顯，表明Taq酶用量1.0 U更為合適。

2.510×Taq buffer（Mg2+ plus）用量對FPNI-PCR的影響

分別以簡并引物FP6和FP7進行擴增，通過改變10×Taq buffer（Mg2+ plus）用量，其他條件均相同，結果見圖5。結果顯示，以簡并引物FP6擴增，3種緩沖液用量均獲得條帶，但用量為2 μL時，目的條帶更為清晰；以簡并引物FP7擴增，緩沖液為1.5 μL時無條帶，由1.75 μL增至2 μL時，條帶數量增加，清晰度略有增加。

2.6引物濃度對FPNI-PCR的影響

以FP6和FP7這2種簡并引物擴增，對第3輪引物SP2濃度進行篩選。結果（圖6）顯示，引物濃度為0.25 μmol/L時，均無條帶，隨著引物濃度的上升，條帶數量、亮度明顯增加，非特異性擴增同樣增加，條帶出現模糊現象。由圖6可知，以FP6和FP7為簡并引物擴增，第3輪引物SP2濃度為0.75～1.0 μmol/L時，均有較好結果。但從節約成本、提高條帶清晰度、減少非特異性擴增角度考慮，0.75 μmol/L時更佳。

3結論與討論

3.1結論

從試驗結果來看，FPNI-PCR適合以低濃度DNA為模板，第1輪反應以稀釋后的DNA為模板，20 μL體系中，用量在4.5～10 ng。對三色堇FPNI-PCR第3輪體系進行優化，最優反應體系是：20 μL反應體系中，特異性引物濃度 0.2 μmol/L，引物SP2濃度0.75 μmol/L，Taq DNA酶用量10 U，dNTP用量2 μL，10×buffer（20 mmol/L，Mg2+ plus）用量2 μL，模板為第2輪反應稀釋100倍后取1 μL，ddH2O補足。第3輪反應經溫度篩選，退火溫度64 ℃或66 ℃時條帶最佳。

3.2討論

FPNI-PCR是基于熱不對稱PCR技術原理的PCR方法，共包括3輪PCR反應。其中，第1輪反應中，含3次高嚴謹反應，目的是使高退火溫度的特異性引物SP1與模板序列退火延伸；1次低嚴謹反應，目的是使簡并引物結合到較多的目的序列上；5次熱不對稱的高低特異性循環交替反應，使目的片段得以指數性擴增。第2、3輪為普通PCR反應，通過特異性嵌套引物進一步擴增目的條帶。它與普通TAIL-PCR的主要區別在于給出了經過優化后的一系列簡并引物，并在簡并引物的基礎上設計了嵌套的特殊引物FSP1、FSP2用于第2、3輪的擴增[2]。特異性嵌套引物的存在，使非目的條帶得不到大量擴增，而非目標序列中的發卡結構也能抑制其擴增，從而提高了目的片段擴增的準確性[11]。

由于FPNI-PCR反應步驟較多，因此影響擴增結果的因素也較多。首先，第1輪的高低嚴謹熱不對稱反應是目標片段擴增的最初環節，而本試驗證明，模板濃度是影響第1輪反應結果的關鍵因素。在研究中發現，低濃度的DNA模板更容易獲得擴增結果，且模板DNA的稀釋倍數對不同簡并引物擴增的影響不同。在其他PCR反應的研究中同樣發現，植物DNA模板的濃度對于目的片段的擴增具有很大的影響[12]。在TAIL-PCR中，通常需要對模板進行稀釋，才能獲得較為清晰的條帶[4，13]。原因可能是DNA中所含雜質的影響，未稀釋的高濃度DNA中所含雜質更多，影響條帶擴增，另外，不同簡并引物對模板的濃度要求也可能不同，所適應的模板濃度存在差異。

在FPNI-PCR反應中，第1輪擴增產物因條帶雜、濃度低，往往無法通過凝膠成像顯示，需要通過第2輪對目標條帶的進一步擴增獲得初步結果。通過第2輪產物凝膠成像，以有條帶的第2輪稀釋產物為模板，通過第3輪反應進一步擴增，以期獲得較第2輪更為清晰的條帶。因此，第3輪反應體系的優化對最終結果的獲得具有重要作用。

本研究中，針對第3輪PCR反應中部分因素進行了優化，結果發現，與buffer（Mg2+ plus）、Taq DNA酶用量相比，引物的濃度影響最為顯著，隨著引物濃度的上升，條帶數量、亮度明顯增加。需要注意的是，較高的引物濃度雖有利于擴增，但會造成條帶模糊、非特異性條帶增加，這與其他PCR反應類似[14]，不利于與第2輪條帶比對推測目的條帶。雖然 FPNI-PCR中融合引物特殊且相對較短，有利于與DNA模板結合擴增目的條帶，但經過3輪反應雖然在一定程度上降低了非特異條帶的干擾，但雜條帶的影響仍是影響試驗結果的重要原因[15]。因此，在第3輪反應中選出最適當的引物濃度，具有十分重要的作用。含Mg2+ 的buffer緩沖液主要對引物和模板的退火、Taq DNA酶的穩定起作用，當緩沖液低于一定限度不能產生條帶，但用量過多也會使dNTP過量結合，非特異性條帶增加，不利于反應[16-17]。與緩沖液相對應，Taq DNA酶用量的多少，同樣對PCR反應存在直接影響，不同的Taq酶需要配合相應的緩沖液使用，過少無法產生條帶，過多也會造成非特異性擴增[18-19]。在本試驗中，較高的buffer濃度和Taq DNA酶均有利于擴增。

PCR反應中除各因素外，退火溫度對目的條帶的獲取同樣具有重要作用。相關研究發現，對熱不對稱PCR第3輪反應退火溫度的優化，能有效地促進目的片段的富集[20]。本試驗第3輪PCR反應中，特異性引物的Tm值為65 ℃，通過溫度篩選得出，退火溫度為64 ℃或66 ℃時，條帶更為清晰。

綜上所述，本研究發現，在FPNI-PCR中通過優化反應體系中各因素的濃度或用量，篩選3輪PCR的退火溫度，均能有效地增加目的條帶的清晰度，減少非特異性擴增，為后續研究打下良好基礎，為其他物種基因啟動子的研究提供一定的借鑒作用。

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