煙草黑脛病生防菌的篩選鑒定及發酵條件優化

劉暢++許家來++郭凱

摘要：從山東煙田土壤中篩選對山東煙草黑脛病（Phytophthora parasitica var.nicotianae）具有較強拮抗作用的生防菌株。通過稀釋涂布法初篩后，用平板對峙法復篩到拮抗效果較好的菌株YCG-2，根據菌株形態與培養特征、ITS序列分析進行鑒定，該菌株與哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的親緣關系較近，且形態與培養特征與哈茨木霉基本相符，因此鑒定為哈茨木霉。通過單因素試驗和正交試驗優化培養基組分及發酵條件，最優發酵條件為每500 mL瓶 20 g 菇渣，料水比為1 g ∶3.0 mL，種子液接種量1×107 CFU/g，pH值7.0，最適溫度28 ℃，恒溫恒濕培養箱中培養6 d。

關鍵詞：煙草黑脛病；哈茨木霉；發酵條件；正交試驗

中圖分類號： S435.72文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0167-04

煙草黑脛病的病原菌為煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae Breda或P. parastica var. nicotianae Tucker）[1]，隸屬于藻物界（Chromista）、卵菌門（Oomycota）、卵菌綱（Oomycetes）、腐霉目（Pythiales）、腐霉科（Pythiaceae）、疫霉屬（Phytophthora）[2]。煙草黑脛病是世界性的嚴重病害，在我國發生較為普遍，特別在河南和山東黃淮煙區嚴重影響煙草產量和質量[3]。山東省是老重病區，曾因推廣抗病品種在生產上起到較好的作用，但年發病率仍在5%～20%，如1981年安丘縣曾因此病絕產667 hm2以上[4]。在不采取防治措施情形下，會出現毀滅性災害[5]。目前煙草生產上抗黑脛病品種效果有限，黑脛病的防治主要依賴甲霜靈等苯基酰胺類殺菌劑，且防治藥物品種單一[6]。

隨著煙草和煙草制品逐步向無公害方向發展，生物防治方法應運而生，能夠有效克服農藥殘留和病菌抗藥性的問題，生防菌通過與病原真菌的拮抗作用來防治煙草黑脛病。近年來，國內已有不少關于煙草黑脛病生防菌方面的研究。如普城沙雷菌、綠針假單胞菌、黏類芽孢桿菌等細菌都對煙草疫霉有較強的拮抗作用[7-8]。喻會平等篩選出的復配細菌菌株對煙草黑脛病有很好的防治效果[9]。張良等研究顯示，長柄木霉（Trichoderma longbrachitum）和涇陽鏈霉菌（Streptomyces jingyangensis）是具有較高親和性的增效組合，2個菌株復配后可有效促進煙苗生長和防治煙草黑脛病[10]。但目前為止，篩選出煙草疫霉菌的拮抗菌以細菌居多，真菌較少，且在實際生產中的應用很少。本研究擬從山東省濰坊市洛莊煙草實驗站煙田的土壤中分離、純化、篩選拮抗菌，并對拮抗效果較好的真菌菌株進行了發酵條件的優化，為后期驗證該菌株在田間的防治效果，利用該菌株制作菌肥，并應用于煙田奠定基礎。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1樣品來源2014年6月從山東省濰坊市洛莊煙草實驗站附近煙草黑脛病發生較為嚴重的煙田采集土壤5份。采集土壤時，選取病煙株集中地塊附近無病煙株，收集煙株根周圍土壤，每塊煙田取3株，3株煙的根周圍土等量混為1份樣品，分裝入無菌50 mL刻度塑料試管內，貼上標簽后帶回實驗室分離拮抗菌。

1.1.2主要試劑和儀器引物（ITS 1、ITS 4）、Taq mix 購自上海生工生物有限公司，Marker購自Takara公司，其余試劑均為國產分析純試劑。電泳儀、PCR為Bio-Rad，顯微鏡為Nikon eclipse E100 。

1.1.3培養基及發酵材料PDA培養基（培養篩選出的拮抗真菌）購自北京奧博星生物技術有限公司，LB培養基（培養篩選出的拮抗細菌，含胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物 5.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂 15.0 g/L，pH值 7.0），燕麥培養基（OA，燕麥 60.0 g/L，瓊脂18.0 g/L），發酵材料為蘑菇渣（蘑菇渣為主要發酵材料，來自山東省棗莊冠宇食用菌有限公司）。

1.2拮抗菌的初篩

5份土壤每份取10 g于盛有90 mL無菌水的三角瓶中，搖床150 r/min振蕩30 min，記作1×10-1。取1 mL懸濁液至含有9 mL無菌水的試管中，渦旋60 s，記作1×10-2，依次稀釋至1×10-5。取1×10-4和1×10-5這2個濃度上清液各100 μL涂板，3次重復，板中央接病原菌煙草黑脛病WZL-072（由筆者所在實驗室分離獲得）。28 ℃下培養3～5 d，挑取周圍無病原菌絲生長的菌株進行分離純化。

1.3拮抗菌的復篩

采用平板對峙法，將初篩出來的拮抗菌與煙草黑脛病原菌株WZL-072進行對峙。

1.3.1拮抗細菌與WZL-072對峙試驗將5 mm打孔器打孔的WZL-072菌塊置于OA培養基上，4個大小相同無菌濾紙片等距離放于WZL-072四周，吸取5 μL 180 r/min、28 ℃培養12 h的拮抗細菌菌液滴于濾紙片上，以等量無菌水為對照，各3次重復。28 ℃下培養5～7 d，每天測量WZL-072菌落直徑。

1.3.2拮抗真菌與WZL-072對峙試驗利用5 mm打孔器分別打孔拮抗真菌與WZL-072，各取1塊置于OA培養基上進行對峙培養，各3次重復。28 ℃下培養5～7 d，每天測量WZL-072菌落直徑。

1.3.3抑菌率的計算

抑菌率=對照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑對照病原菌菌落直徑×100%。

1.4菌株的鑒定

1.4.1形態學鑒定滴1滴乳酸酚棉蘭染色液于載玻片中央，膠帶粘取一點轉接3 d的YCG-2 菌絲放于染色液上，濾紙吸去多余的染色液，在10×40、10×100倍的光學顯微鏡下觀察菌絲形態、孢子的大小及形狀。參照喻璋等的方法[11]進行形態學鑒定。

1.4.2分子生物學鑒定樣品DNA的提取按照艾德萊生物公司的“真菌基因組DNA快速提取試劑盒”中的方法進行，用真菌通用引物（ITS 1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行擴增[12]，測定其序列。通過Blast程序，從NCBI公共數據庫中進行相似性搜索，選取相似性最高且是有效發表的典型菌株的序列，用clusta lX 進行序列比對，用MEGA 4.0的Neighbor-Joining 法選取前250個最好的比對結果構建系統進化樹，確定 YCG-2菌株的分類地位。

1.5發酵條件的優化

1.5.1種子液的制備及種子液孢子濃度檢測種子液的制備：稱20 g菇渣于500 mL三角瓶中，加蒸餾水50 mL，料水比為1 g ∶2.5 mL，121 ℃滅菌40 min，接種5-10塊菌塊，28 ℃培養6 d。加150 mL無菌水，搖勻后用2層無菌紗布過濾，濾液 5 000 r/min 離心10 min，倒掉上清液，加30%甘油重懸孢子液，混勻后分裝入凍存管中，-80 ℃保存。采用活菌計數法檢測種子液孢子濃度：取1 mL種子液，梯度稀釋后進行平板培養（培養基內加入曲通抑制菌絲生長）。培養溫度 28 ℃，時間48 h，3次重復。

1.5.2單因素試驗選擇裝料量、溫度、料水比、接種量、pH值作為影響YCG-2菌株生長的主要因素，通過單因素試驗選取正交試驗的因素和水平。基本條件為裝料量20 g蘑菇渣，料水比為1 g ∶2.5 mL，pH值自然，接種1 mL濃度1×107 CFU/g 的孢子液，28 ℃培養6 d后取出計算活菌數。在基本條件基礎上，按照表1所列指標逐項進行單因素試驗。每個處理3次重復。

表1單因素水平梯度設置

料水比

（含水率）接種量

（CFU/g）裝料量

（g）pH值培養溫度

（℃）1 ∶1.5（60%）1×10455.0221 ∶2.0（67%）1×105105.6251 ∶2.5（71%）1×106156.0281 ∶3.0（75%）1×107206.5311 ∶3.5（80%）1×108257.034

1.5.3正交試驗設計根據單因素試驗結果，選取料水比（X1）、裝料量（X2）、培養溫度（X3）3個因素為考察對象，以活菌數量為評價指標，進行正交試驗，3次重復，試驗因素水平及編碼見表2。

1.6數據處理與分析

采用STATA方差分析軟件及 Microsoft Excel 2003統計軟件進行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用SPSS 16.0軟件進行正交分析。

2結果

2.1拮抗菌的初篩

從采集到的5份土樣中初篩得到26株純培養拮抗細菌，編號為YCG-B1至YCG-B26，8株純培養拮抗真菌，編號為YCG-1至YCG-8。

2.2拮抗菌的復篩

如表3所示，采用對峙培養法進一步篩選，共篩選到7株菌株有抑制效果，其中6株細菌、1株真菌，抑菌率67.42%～84.34%，抑菌效果最好的是YCG-2，抑菌率達到84.34%。

2.3經典分類學特征

觀察發現：在PDA培養基上，YCG-2菌株菌落開始為白色絮狀，逐漸變為綠色，后期變為暗綠色，顏色由淺變深，狀態由絮狀逐漸變得緊而密。通過光學顯微鏡觀察發現：YCG-2菌株的菌絲纖細無色，具分隔，多分枝，分枝間夾角呈銳角。分生孢子梗從菌絲的側枝上生出，對生或互生，一般有2～3次分枝，著生分生孢子的小梗瓶形或錐形。分生孢子多為球形（圖1）。

2.4系統發育學特征

用真菌通用引物ITS 1和ITS 4擴增菌株YCG-2的核糖體DNA，得到595 bp的 ITS DNA序列，利用Blast程序與NCBI中已登錄的基因序列進行比對，選取與其同源性較高且已定名的菌株的相關序列信息，進行系統發育分析，取前250個最好的比對結果建樹（圖2），可以看出，菌株YCG-2的序列與哈茨木霉的序列相似性較高。

2.5拮抗菌株YCG-2發酵條件優化單因素試驗結果

2.5.1料水比變化對YCG-2孢子產量的影響由圖3可見，料水比對菌株YCG-2的生長有很大影響，料水比為

1 g ∶1.5 mL時，YCG-2菌株的孢子產量最少，孢子數為8.00×108 CFU/g；料水比為1 g ∶3.0 mL時YCG-2產生的孢子最多，達到29.00×108 CFU/g，所以1 g ∶3.0 mL為菌株YCG-2產生孢子的最佳料水比。

2.5.2接種量變化對YCG-2孢子產量的影響由圖4可知，接種量對YCG-2菌株的生長有一定影響，在裝料20 g蘑菇渣，料水比為1 g ∶3.0 mL，自然pH值，28 ℃條件下，隨著接種量的增大，YCG-2孢子產量也會增加，接種量為1×107 CFU/g 時YCG-2孢子產量最大，孢子數達到29.50×108 CFU/g，當接種量繼續增大，YCG-2菌株的活菌數則急劇降低，這可能是因為蘑菇渣中的菌體過多，導致營養成分不能滿足過量菌體的生長，從而影響活菌數。

2.5.3裝料量變化對YCG-2孢子產量的影響由圖5可見，YCG-2菌株的孢子產量隨著裝料量的增加，孢子產量越高，此時料水比為1 g ∶3.0 mL，自然pH值，接種1 mL濃度 1×107 CFU/g 的孢子液，溫度28 ℃。在每瓶20 g裝料量情況下菌株的生長狀況最好，孢子產量達到最高值29.01×108 CFU/g。當裝料量達到每瓶25 g時，孢子產量有所降低，這可能與物料堆積過多造成透氣量下降有關。

2.5.4初始pH值變化對YCG-2菌株生長的影響用氫氧化鈉溶液調節物料pH值。從圖6可以看出，在試驗所設置的pH值梯度區間內（5.5～7.5），YCG-2菌株都能生長，且在pH值為7.0時孢子產量達到最高值。在pH值為7.0時YCG-2的產孢量最多，達到40.11×108 CFU/g。物料pH值偏大或偏小，孢子產量均減少。

2.5.5溫度變化對YCG-2菌株生長的影響分別在22、25、28、31、34 ℃下進行培養，測定不同溫度下的活菌數，結果（圖7）表明，溫度變化對YCG-2菌株的生長影響很大。在28 ℃下孢子產量達到最高值39.60×108 CFU/g。隨著溫度的升高，YCG-2孢子產量越來越低，34 ℃時孢子產量降低到6.0×104 CFU/g。

2.6孢子產生條件優化正交試驗

為了驗證單因素試驗結果，通過SPSS統計軟件設計正交試驗。本試驗選取裝料量、培養溫度、料水比3個因素為考察對象，進行正交試驗設計。每個試驗重復3次，取其平均值，正交試驗結果與分析見表4，方差分析見表5。

由表5可知，3個因素對YCG-2菌株生長的影響作用大小依次為A>B>C，即裝料量>溫度>料水比。通過該正交試驗結果確定最佳組合水平為A2B2C2。在裝料量為20 g、培養溫度為28 ℃、料水比為1 g ∶3.0 mL的最佳條件下進行驗證試驗，重復3次，平均產孢量為40.18×108 CFU/g。

3小結與討論

煙草黑脛病是煙草生產中危害最嚴重的土傳病害之一，山東省是受害比較嚴重的產煙省，每年經濟損失高達億元，僅次于煙草病毒病[1]。由于生物防治對環境無污染及不容易產生抗藥性等特點成為病害防治研究的熱點，需要研究和開發環境友好的土傳病害生物防治技術。

本研究從山東省煙草黑脛病發生嚴重的煙田里選擇長勢良好無病煙株，取其根際土，經過初篩和復篩，獲得1株對對煙草疫霉具有較強抑制作用的真菌菌株YCG-2，該菌株的抑菌率最高可達到84.34%。鑒于此，選擇YCG-2菌株作為后期的主要研究對象，利用傳統分類方法和18S rDNA 序列測定法對菌株YCG-2 進行了鑒定，確定菌株YCG-2為哈茨木霉。采用單因素和正交設計試驗對菌株YCG-2進行發酵條件的優化，得到其最佳發酵配方和最適發酵條件。最適培養溫度為28 ℃，pH值為7.0，這與莊敬華等[13]、于曉丹等[14]的關于木霉發酵條件研究結果相似，但張愛華等[15]關于哈茨木霉發酵條件的初步研究結果顯示最適培養溫度為 22 ℃，本研究結果與之相差較大，可能是因為哈茨木霉菌株不同、所用培養基不同等。

為了能降低菌種擴大生產成本，本試驗以廢棄菇渣為培養基質，并以孢子產生量為指標，優化了相應的發酵條件，為推廣應用打下了基礎。Harman研究認為，木霉的生防作用與其根際定殖能力密切相關[16-17]，因此YCG-2菌株的根際定殖能力有待于進一步研究，以期能盡快將其推向大田應用。

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