基于形態學特征和ITS序列分析秦巴山區天麻萌發菌的親緣關系

虞小燕++鄧百萬++陳文強

摘要：利用拮抗試驗，萌發試驗和ITS序列分析技術對秦巴山區12個天麻萌發菌菌株進行了親緣關系分析。結果表明：12個萌發菌菌株分為兩大類，其中8103-4、8103-6、8103-7、8103-8這4個菌株與其他菌株拮抗反應明顯，并且ITS序列分析顯示在同一個分支上，親緣關系相近；萌-3、萌-7、萌MD-2、萌發菌、石斛-1、石斛-2、萌-云南此8個菌株拮抗反應不明顯，ITS序列分析顯示在同一個分支上，8103-3、萌發菌與標準菌種Mycena citrinomarginata親緣關系相近，萌MD-2、石斛小菇-1、萌-3、萌-7、石斛小菇-2、萌-云南與Mycena purpureofusca親緣關系相近。

關鍵詞：天麻萌發菌；拮抗；rDNA序列；親緣關系

中圖分類號：S182文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2016）05-0245-04

萌發菌隸屬于擔子菌綱（Basidiomyeetes）傘菌目（Agarieales）口蘑科（Trieholomataeeae）小菇屬（Myeena）[1]，主要包括紫萁小菇（M . mosmundicola）、石斛小菇（M . mdendrobii）和開唇小菇（M . manoectochila）三大類屬。天麻萌發菌主要分布于我國陜西、云南、甘肅、河南、河北、湖南、湖北、貴州、新疆、四川、安徽、黑龍江、吉林、廣西、海南、福建、內蒙古、西藏及臺灣等省區[2]，為天麻（Gastrodia elata）有性繁殖時的必要共生菌。天麻種子細小如粉塵，無胚乳及其營養貯備，無外源營養供給，種子不能發芽。它的萌發靠小菇屬（Mycena）一類真菌菌絲侵染種胚提供營養，促使其萌發[3]。隨著天麻藥用需求不斷增加，野生資源日益匱乏，且人工栽培中以無性繁殖來連續種植，天麻球莖明顯退化，側芽發芽率低等原因，經過有性繁殖培育0代天麻或1代天麻，再通過無性繁殖擴大種植已成為天麻穩產和高產的重要途徑[4-5]。目前，國內外對天麻萌發菌種質資源研究報道較少，且主要集中于地區優良栽培品種的篩選和生物學特性的研究，如冉孝琴等對貴州天麻萌發菌優良菌株進行了篩選[6]；李方安等對紫萁小菇生物學特性進行了初步研究[7]。

由于天麻萌發菌菌株市場上命名混雜，且物種間形態差異不大，通過形態鑒定較為困難。目前，秦巴山區天麻萌發菌菌種的親緣關系尚無相關研究報道，萌發菌菌種的種源關系不明確，缺少適宜地域栽培生長的天麻萌發菌菌種，對于培育出適合秦巴山區栽培的優良高產菌種的難度較大。利用rDNA ITS序列分析技術[8]，可以直接提取蘊含于基因組內的遺傳信息，檢測和比較傳統形態學無法區分的相似菌株種間或種內差別，具有快速、靈敏、準確的優點。筆者選取秦巴山區8103-3、8103-4、8103-6、8103-7、8103-8、萌-3、萌-7、萌MD-2、萌發菌、石斛-1、石斛-2、萌-云南共12個天麻萌發菌主要栽培菌株，對其形態特征及核糖體轉錄間隔區（ITS）進行序列分析，并進一步對ITS序列進行核酸序列數據庫GenBank同源性檢索比對，構建系統發育樹，以期為基于傳統形態特征對秦巴山區天麻萌發菌菌株之間的親緣關系提供分子依據，為天麻萌發菌建立種質資源庫及優良菌種的選育提供依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株8103-3、8103-4、8103-6、8103-7、8103-8、萌-3、萌-7、萌MD-2、萌發菌、石斛-1、石斛-2、萌-云南共12株萌發菌菌株：由陜西省資源生物重點實驗室食藥用菌菌種保藏中心提供。

1.1.2改良CPDA培養基包括馬鈴薯200.0 g，玉米粉 50.0 g，葡萄糖20.0 g，KH2PO4 5.0 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，NH4NO3 5.0 g，維生素B1 10 mg，瓊脂 15.0 g，加水至1 000 mL，pH值自然。CPDA液體培養基，根據上述改良CPDA培養基配制，但不加添瓊脂。

1.2方法

1.2.1拮抗試驗制備試管斜面培養基，活化各菌株，每株3管；取試管活化菌株在同一培養皿上對稱接種2個菌株，24 ℃ 恒溫培養7 d，觀察菌絲間的拮抗反應情況。

1.2.2萌發試驗青岡木樹葉浸泡24 h后，平鋪在培養皿表面，接種各萌發菌菌株，每株3個，24 ℃ 恒溫培養7 d，選取未開裂、顏色較深、富有彈性且大小相近的天麻果實，均勻播撒在培養皿中，24 ℃ 恒溫培養60 d，期間定期定量加水，觀察萌發情況。

1.2.3液體發酵制備CPDA液體培養基，分裝于250 mL三角瓶中，每瓶裝液量150 mL，于1.034×105 Pa滅菌 30 min，冷卻后將活化的菌株接種至液體搖瓶中，靜置24 h后，24 ℃、160 r/min振蕩培養7 ～12 d。用3層無菌紗布過濾菌絲球，再用無菌水洗滌過濾2～3次，最后用無菌濾紙吸干水分收集菌絲體。4 ℃冰箱保存，備用。

1.2.4DNA的提取及擴增采用CTAB法提取供試菌絲體的基因組DNA[10]；PCR擴增：ITS引物：ITS 1（5′-3′）TCCGTAGGTGAA-CCTGGG，ITS 4（5′-3′）TCCTCCGCTTATTGA-TATGC。PCR反應體系：2×Taq PCR Green Mix 15 μL，引物ITS 1、ITS 4各2 μL，模板DNA 2 μL，加滅菌雙蒸水至30 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。采用1%的瓊脂糖凝膠進行45 min電泳。

1.2.5測序及構建系統進化樹經瓊脂糖凝膠電泳檢測的上述PCR產物由上海生工生物技術服務有限公司進行雙向測序。將所測的序列用Clustal-W軟件進行對位排列，然后手工適當校正。隨后將調整后的序列提交GenBank數據庫并進行Blast檢索，下載同源性較高的序列。利用Mega 6軟件構建系統發育樹。

2結果與分析

2.112株天麻萌發菌的拮抗反應

12株天麻萌發菌通過相互之間的兩兩接觸性試驗，結果見圖1、表1，分析得出8103-4、8103-6、8103-7、8203-8之間無拮抗反應或反應不明顯，與其他菌株之間拮抗反應明顯，故此4株菌親緣性相近；萌-3、萌-7、萌發菌、石斛-1、萌-云南之間無拮抗反應或反應不明顯，與8103-3，萌MD-2，石斛-2之間拮抗反應微弱，故可將此8株菌分成2組來進一步研究。

2.212株萌發菌對天麻種子萌發研究

12株天麻萌發菌與天麻種子伴栽后萌發情況見圖2、表2。萌-3、萌-7、萌發菌、石斛-1、萌-云南 5株菌中天麻種子萌發數量多，萌發均勻，天麻生長健壯，色澤鮮艷；8103-4、8103-6、8103-7、8203-8這4株菌中天麻種子萌發數量稀少或沒有，天麻瘦小萎蔫，色澤暗淡；8103-3、萌MD-2、石斛-2中天麻種子萌發數量較少，天麻種子萌發不均勻，天麻生長良好，色澤鮮艷。

2.3供試菌株ITS-PCR擴增后電泳結果

取5 μL PCR產物，用10 g/L瓊脂糖凝膠（TBE緩沖液）電泳檢測，于Tanon 3500R凝膠成像系統（中國TANON公司產品）拍照，電泳結果見圖3。

由圖3可見，12個天麻萌發菌菌株的基因組DNA經PCR擴增后獲得了單一的條帶，菌種的rDNA ITS區域的序列片段長度大小為600 bp。將所獲得的12個ITS序列提交給NCBI公共數據GenBank進行比對，分析得到8103-3、8103-4、8103-6、8103-7、8103-8、萌-3、萌-7、萌MD-2、萌發菌、石斛-1、石斛-2、萌-云南收錄號依次為：KT149154、KT149155、KT149156、KT149157、KT149158、KT149159、KT149160、KT149161、KT149162、KT149163、KT149164、KT149165。

2.3系統發育樹分析

從GenBank上進行Blast檢索，下載同源性較高的菌株序列，用Clustal-W軟件對所有序列進行人工校正，再用MEGA 6采用臨近相鄰法聚類，經自舉法檢驗（1 000次重復）構建系統發育樹。

菌株菌絲特征天麻長勢特征種子出芽快慢8103-3潔白，致密，絨毛狀分布不均勻，個體差異大，出現畸形，色澤鮮艷，分支多緩慢8103-4潔白，稀疏，絨毛狀分布均勻，個體瘦小萎蔫，色澤暗淡較快8103-6潔白，稀疏，絨毛狀分布均勻，個體瘦小萎蔫，色澤暗淡較快8103-7潔白，稀疏，絨毛狀分布均勻，個體瘦小萎蔫，色澤暗淡較快8103-8潔白，稀疏，絨毛狀分布均勻，個體瘦小萎蔫，色澤暗淡較快萌-3潔白，致密，絨毛狀大小均一，生長健壯，色澤鮮艷，分支多，分布均勻快萌-7潔白，稀疏，絨毛狀大小均一，生長健壯，色澤鮮艷，分支多，分布均勻快萌MD-2潔白，稀疏，絨毛狀分布不均勻，個體差異大，出現畸形，色澤鮮艷，分支多緩慢萌發菌潔白，稀疏，絨毛狀大小均一，生長健壯，色澤鮮艷，分支多，分布均勻快石斛-1潔白，致密，絨毛狀大小均一，生長健壯，色澤鮮艷，分支多，分布均勻快石斛-2潔白，稀疏，絨毛狀分布不均勻，個體差異大，出現畸形，色澤鮮艷，分支多緩慢萌-云南潔白，致密，絨毛狀大小均一，生長健壯，色澤鮮艷，分支多，分布均勻快8103-4、8103-6、8103-7、8103-8這4個菌在同一個分支上，親緣關系密切，與已知序列相似度為99%，但在進化樹上形成了單獨的分支，這可能是新的分類單元；8103-3、萌-3、萌-7、萌MD-2、萌發菌、石斛-1、石斛-2、萌-云南這8個菌在同一個分支上，其中8103-3、萌發菌與標準菌Mycena citrinomarginat親緣關系比較近，萌MD-2、石斛小菇-1與標準菌種Mycena purpureofusca親緣關系非常近。

3討論與結論

真菌的拮抗反應是體細胞不親和的直接體現。在真菌界，體細胞不親和現象普遍存在。此方法具有簡單、快捷、直觀等優點。是常用的真菌菌種鑒定方法；ITS rDNA區進化速率較快，在絕大多數真核生物中表現出極為廣泛的序列多態性，對高等植物和大型真菌鑒定有很好的準確性和靈敏性，適用于不同真菌鑒定及系統發育分析。結合拮抗反應和ITS序列分析對天麻萌發菌進行親緣關系分析具有極高的準確性。

本研究應用拮抗反應和萌發特性對萌發菌菌株進行研究，對其中菌絲粗壯，菌落致密，生長速度快萌發效果好的菌種進行標記篩選，通過對12株天麻萌發菌間的拮抗反應以及與天麻種子萌發試驗的分析，大致將12株萌發菌分為3類：萌-3、萌-7、萌發菌、石斛-1、萌-云南，此5株菌株長勢相同，萌發效果好，株長勢相同，與其他菌株拮抗反應明顯，萌發效果不理想；103-3、萌MD-2、石斛-2此3株菌與8103-4、8103-6、8103-7、 8103-8拮抗反應明顯與其他菌株拮抗反應不明顯，萌發效果較好。應用ITS序列分析技術，對秦巴山區天麻萌發菌菌種進行了測序分析，將其分為2類，其中8103-4、8103-6、8103-7、 8103-8這4個菌在同一個分支上，相似度為100%，親緣關系相近，但在進化樹上形成了單獨的分支，形成了新的分類單元；萌-3、萌-7、萌MD-2、萌發菌、石斛小菇-1、石斛小菇-2、萌-云南8個菌在同一個分支上，其中8103-3、萌發菌與標準菌Mycena citrinomarginata親緣關系比較近，萌MD-2、石斛-1、萌-3、萌-7、石斛-2、萌-云南與標準菌株Mycena purpureofusca親緣關系較近。這與拮抗試驗及萌發試驗得到的結論大致相同。由于在實際生產種存在突變、變異、進化的原因，菌株間存在物種多樣性的影響，對秦巴山區12個天麻萌發菌供試菌株進行RAPD和酯酶同工酶指紋圖譜的分析還有待進一步研究。

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