刺芹側耳原生質體的再生及多糖含量差異

李艷麗++金周雨++李玉

摘要：采用溶壁酶進行刺芹側耳菌絲原生質體的制備，研究培養基、滲透壓穩定劑和稀釋劑PPRL對原生質體再生率的影響，以從中篩選原生質體再生的最佳培養條件。對再生菌絲進行發酵培養，提取原生質體再生菌株菌絲體胞內多糖（IPS）、發酵液胞外多糖（EPS），并進行含量測定。結果表明：最佳再生培養基為PPR，滲透壓穩定劑、稀釋劑均為0.6 mol/L甘露醇；此時原生質體經過14 d左右的培養可再生出白色菌落，再生率為0.76%；原生質體再生菌絲IPS、EPS含量差異明顯，多株高于親本菌株。研究結果為刺芹側耳高產多糖菌株的選育奠定了前期基礎。

關鍵詞：刺芹側耳；多糖含量；原生質體；再生率

中圖分類號： S646.1+41.03文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0255-03

eryngii）別稱杏鮑菇，是一種珍稀美味食用菌[1]，它不但營養豐富[2]，而且具有保健功能[3-5]。近年的研究表明，刺芹側耳富含有藥理活性的多糖，展現了較強的抗氧化作用[6]、抗腫瘤活性[7-8]以及降脂活性[9]。因此可知，刺芹側耳及其多糖已經逐漸成為人們研究的熱點。

原生質體是一種具有生物全能性的細胞，在食用菌的遺傳育種領域具有重要應用[10-12]。本研究探索再生條件對刺芹側耳原生質體再生率的影響，旨在篩選出再生率最高的培養條件；同時對原生質體再生菌株菌絲體胞內多糖（IPS）、發酵液胞外多糖（EPS）進行提取，并測定其含量，以期為刺芹側耳高產多糖菌株的選育奠定前期基礎。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株為刺芹側耳菌株HB3，購自吉林省高新技術園區。溶壁酶購自廣東省微生物研究所。

培養基及其配方如下。PDR：200 g馬鈴薯、2 g葡萄糖、20 g瓊脂粉、0.6 mol/L甘露醇，用蒸餾水補足至1 000 mL。

POR：在PDR中添加3 g KH2PO4、1.5 g MgSO4、10 mg維生素B1。PPR：在POR中添加2 g蛋白胨、2 g酵母膏。CMR：20 g葡萄糖、2 g蛋白胨、2 g酵母膏、0.46 g KH2PO4、1.0 g K2HPO4、0.5 g MgSO4、20 g瓊脂粉、0.6 mol/L甘露醇，用蒸餾水補足至1 000 mL。PMR：10 g麥芽糖、4 g葡萄糖、4 g酵母膏、1.0 g KH2PO4、1.0 g MgSO4、10 g可溶性淀粉、20 g瓊脂粉、0.6 mol/L甘露醇，用蒸餾水補足至1 000 mL。YPR：30 g玉米粉、20 g葡萄糖、1.0 g蛋白胨、1.0 g KH2PO4、0.5 g MgSO4、20 g瓊脂粉、0.6 mol/L甘露醇，用蒸餾水補足至 1 000 mL。

以上培養基于121 ℃高壓滅菌20 min，備用。

1.2試驗方法

1.2.1原生質體的制備采用相應文獻的方法[13]。

1.2.2原生質體的再生將原生質體懸液用0.6 mol/L甘露醇適當稀釋，取100 μL涂布于再生培養基中，置于25 ℃恒溫培養箱中避光培養，同時用蒸餾水稀釋原生質體懸液作為空白對照。再生率計算公式：

再生率=再生培養基中菌落數/涂布的原生質體數×100%。

1.2.3培養基種類對再生率的影響用“1.1”節中培養基進行原生質體再生，考察其對再生率的影響。

1.2.4滲透壓穩定劑對再生率的影響以甘露醇、蔗糖、MgSO4、NaCl作為滲透壓穩定劑，分別考察其在濃度為0.4、0.6、0.8 mol/L時對再生率的影響。

1.2.5PPRL對再生率的影響PPRL為PPR的液體培養基，考察其對原生質體再生率的影響。

1.2.6再生菌株多糖的發酵培養、提取及含量的測定隨機篩選原生質體再生菌株10株（編號為SH1至SH10），先經PPA（無0.6 mol/L甘露醇的PPR）活化培養，然后用直徑 1 cm 打孔器取出2塊菌絲，接種在CMA（無0.6 mol/L甘露醇的CMR液體培養基）中，于25 ℃、160 r/min培養5～6 d，轉接至CMA加富培養基（CMA中添加20 g玉米浸汁）中，于25 ℃、160 r/min培養9 d，真空抽濾菌絲，冷凍干燥。采用相應文獻方法提取IPS、EPS[14]，采用苯酚硫酸法測定含量[15]。

2結果與分析

2.1原生質體的制備及再生

由圖1可見：鏡檢下原生質體呈現球狀，無殘余菌絲片段，說明采用本試驗方法可獲得純凈的刺芹側耳原生質體，且產量較高，達到6.34×107個/mL。經過12～14 d的培養，原生質體可以萌發出幼眼可見的白色菌落，空白對照則無再生菌落生長，進一步說明原生質體純化較好。經過一段時間的培養，可見菌落形態各異，或濃密，或稀疏，且大小不等。有的菌落形態較特殊，中心、外周突起，形成1個環狀凹陷（圖1-Ⅱ中箭頭指示）；有的菌落間會產生拮抗（圖1-Ⅲ中箭頭指示）。這些現象表明，再生菌落之間遺傳性狀差異明顯。

2.2培養基種類對再生率的影響

培養基種類對再生率的影響如圖2所示：PPR培養基再生率最高，為0.76%；其次是PMR、YPR、CMR，再生率與PPR相差不明顯；再次是POR、PDR，它們的再生率明顯偏低，PDR的再生率僅為0.32%。

此外，原生質體在不同培養基中再生成菌落時間并不一致。在YPR中約12 d，而在其他培養基中約14 d，可見再生培養基成分對原生質體再生率有較大影響。綜上可知，PPR、PMR、YPR、CMR均有利于原生質體的再生，可作為再生培養基使用，本試驗選取PPR作為最終再生培養基。

2.3滲透壓穩定劑對再生率的影響

由圖3可知：甘露醇、蔗糖作為滲透壓穩定劑的再生率明顯高于無機滲透壓穩定劑MgSO4、NaCl，且再生率與滲透壓穩定劑的濃度明顯相關，當濃度為0.6 mol/L時（除0.8 mol/L蔗糖），原生質體的再生率最高，其次是0.8 mol/L，濃度為0.4 mol/L 時再生率最低。0.6 mol/L的甘露醇再生率達到0.76%，0.4 mol/L NaCl 再生率僅為0.25%。綜上可知，0.6 mol/L 甘露醇、0.6～0.8 mol/L蔗糖均有助于刺芹側耳原生質體的再生，可作為滲透壓穩定劑使用，因此本試驗選取0.6 mol/L甘露醇作為最終的滲透壓穩定劑。

2.4PPRL對再生率的影響

由圖4可知：PPRL作為稀釋劑，再生率明顯低于0.6 mol/L 甘露醇，僅為0.46%，說明0.6 mol/L甘露醇更有利于原生質體的再生。

2.5多糖含量的測定結果

由表1可知：原生質體再生菌株與親本菌株的IPS、EPS含量差異均較大，有4株再生菌株IPS含量高于親本菌株HB3，分別為SH3、SH4、SH5、SH7，其中SH7最高，為（127.8±3.2）mg/g，比親本菌株高34.8%；有6株再生菌株EPS含量高于親本菌株，分別為SH1、SH2、SH4、SH6、SH8、SH9，其中SH9的EPS含量最高，為（324.4±8.3）mg/L，比親本菌株高42.1%。其他幾株菌株的IPS、EPS含量或接近或低于親本菌株。

3討論與結論

原生質體酶解后需要過濾純化除去殘余的菌絲片段，以減少對原生質體后續操作的影響。本研究通過溶壁酶制備系統較好地實現了原生質體的純化。原生質體再生受到多種因素的影響[16-18]，但有關刺芹側耳原生質體最佳再生條件的研究鮮有報道。

本研究設計了不同的培養基、滲透壓穩定劑及稀釋劑，以期篩選最佳再生條件。結果顯示：PPR培養基為最佳再生培養基，再生率是PDR的2.37倍。筆者認為，與PDR相比，PPR含有蛋白胨、酵母膏等營養物質，它們更有利于原生質體再生為菌絲。0.6 mol/L甘露醇作為最佳滲透壓穩定劑，再生率比0.4 mol/L NaCl高2.04倍。一般認為，有機滲透壓穩定劑比無機滲透壓穩定劑更有利于食用菌原生質體的再生[16-17]，本試驗結果與其一致。有報道稱，真菌細胞壁成分主要為葡萄糖、幾丁質[19]；筆者認為，甘露醇、蔗糖等糖醇類有機滲透壓穩定劑更有利于轉化為真菌的細胞壁物質，這是再生率高的主要原因。

再生菌株、親本菌株IPS、EPS含量測定結果表明，經原生質體再生的菌絲多糖含量與親株相比差異明顯，有幾株多糖含量分別高于親株，暗示其遺傳物質可能發生了變異，這點通過再生菌絲的形態和菌絲間拮抗也可以得到初步證實。通過原生質體再生篩選刺芹側耳高產多糖菌株鮮有報道，因此這些菌株的獲得具有一定的理論和實際參考價值。

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