鵝副黏病毒病的RT—PCR鑒定及病理組織學觀察

黃銀云++胡新崗++郭廣富

摘要：鵝副黏病毒病由副黏病毒科禽副黏病毒Ⅰ型鵝副黏病毒感染引起，主要表現為消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經系統(tǒng)的癥狀和病變。通過臨床病例觀察該病的臨床癥狀和病理變化，利用RT-PCR方法鑒定病原，采用病理組織學技術進行分析。結果表明，鵝副黏病毒是一種泛嗜性病毒，可在鵝體內的多種器官中復制，并造成多器官組織的損傷，從而引起患鵝消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經系統(tǒng)的癥狀和病變。

關鍵詞：鵝；副黏病毒；RT-PCR；鑒定；病理組織；觀察

中圖分類號： S858.335.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0302-03

鵝副黏病毒病是由副黏病毒科禽副黏病毒Ⅰ型鵝副黏病毒感染引起的一種急性、高度接觸性、病毒性傳染病。患鵝主要表現為消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經系統(tǒng)的癥狀和病變[1]，以腸道糠麩樣潰瘍、胰腺腫脹且表面有灰白色壞死灶、脾臟腫大并有大小不等的灰白色壞死灶為主要特征[2]。鵝副黏病毒病于1997年在江蘇省發(fā)現，不同日齡的各品種鵝群不分季節(jié)均易感，發(fā)病率為40%～100%，死亡率達30%～100%，2周齡以內雛鵝的發(fā)病率、死亡率均可達100%，現已成為嚴重影響我國養(yǎng)鵝業(yè)健康發(fā)展的重要疫病[3]。2014年夏季，蘇北地區(qū)某肉鵝場飼養(yǎng)的7周齡獅頭鵝發(fā)生疑似副黏病毒病，根據流行病學調查、臨診癥狀觀察、分子生物學診斷，確診為鵝副黏病毒感染，并進行病理組織學觀察，為該病的正確診斷提供分子生物學及病理組織學方法。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料病料采自蘇北地區(qū)某肉鵝場，該場疑似感染鵝副黏病毒，病鵝的臨床癥狀及肝、脾、胰、肺、腎、腸等病理變化明顯。

1.1.2主要設備RM2235型徠卡切片機，PTC-200rev型PCR儀，DYY-7C型電泳儀，DYCP-31DN型瓊脂糖水平電泳槽，Mikro200R型冷凍高速離心機，JS-380A型自動凝膠圖像分析儀，恒溫箱，微量移液器等。

1.1.3常用試劑10%福爾馬林、乙醇、石蠟、二甲苯、蘇木精、伊紅、鹽酸、樹膠等均為國產試劑。200 bp DNA Ladder Marker購自寶生物工程（大連）有限公司，病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，2×Lamp MasterMix（含染料）購自康為世紀生物科技有限公司。Murine RNase Inhibitor、HiScriptReverse Transcriptase均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。6 nt隨機引物購自Fermentas公司。

1.1.4RT-PCR引物設計與合成根據EMBL/GenBank上已公布病毒的相關基因序列，由上海英濰捷基生物技術有限公司采用Primer premier 5.0引物設計軟件設計NDV-F引物1對，目的基因片段大小為970 bp。F1：5′-GCCGAATTCCCGAATCATCACGACGCTTAA-3′；F2：5′-GTGAAGCTTGAGTCTGTGAGTCGTAC-3′。

1.2方法

1.2.1流行病學調查通過約談鵝場飼養(yǎng)員和技術人員、查看養(yǎng)殖檔案、進行群體觀察和個體檢查，了解該鵝群發(fā)病的具體情況，為鵝副黏病毒病的正確診斷提供流行病學信息。

1.2.2臨床癥狀觀察重點觀察病鵝消化系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的癥狀。觀察病鵝的運動姿態(tài)，有無扭頸、仰頭、轉圈等神經癥狀，有無甩頭、咳嗽等呼吸癥狀。觀察糞便的狀態(tài)及顏色、眼睛有無分泌物等。

1.2.3大體病理剖檢重點檢查肝臟、脾臟、胰腺，特別是全部腸道、盲腸扁桃體。

1.2.4病理組織學觀察采集新鮮病死鵝的消化器官（腺胃、腸）、免疫器官（脾臟、胸腺、法氏囊）、神經器官（腦）等；以福爾馬林溶液固定后，利用乙醇經脫水機自控脫水、二甲苯透明、石蠟包埋；采用切片機切成片厚為4～6 μm的薄片，經蘇木精-伊紅染色（H·E染色）后鏡檢拍照。

1.2.5雙抗PBS的配制將OIE推薦的配方[4]略作調整，采用pH值為7.2的PBS溶液配制運輸液，溶液中青霉素（penicilin）、鏈霉素（streptomycin）的劑量分別為 10 000 unit/mL、10 mg/mL。采用濃度為1 mol/L的NaOH溶液將其pH值調節(jié)至7.2。

1.2.6RNA提取及cDNA轉錄將疑似副黏病毒感染的雛鵝器官病料剪碎，加入預冷雙抗的PBS研磨，反復凍融3次后以3 000 r/min離心10 min，每份吸取200 μL上清液用于病毒基因組的提取。根據病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書進行RNA的提取，測其含量為320 μg/μL。采用6 nt隨機引物進行反轉錄（于65 ℃加熱5 min，迅速置于冰上驟冷并靜置2 min）。根據HiScript Reverse Transcriptase說明書進行反轉錄以獲得病毒的cDNA（置于PCR儀中進行反應，反應程序為50 ℃ 45 min、85 ℃ 5 min）。

1.2.7基因片段的擴增根據2×Lamp MasterMix（含染料）說明書進行PCR擴增。PCR反應條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s；退火溫度為55 ℃，72 ℃下延伸時間為1.0 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產物經凝膠電泳檢測。

2結果與分析

2.1流行病學特點

該鵝場約有7周齡獅頭鵝2 100羽，至送檢時已發(fā)病 7 d，約900羽發(fā)病，發(fā)病率約為43%；病死320余羽，病死率約為36%。部分病鵝發(fā)病5～6 d后逐漸好轉，10 d左右康復。發(fā)病期間未采取隔離措施，僅以氟苯尼考等藥物治療，效果不理想。

2.2臨床癥狀

患鵝病初食欲下降、精神沉郁，糞便稀薄呈白色。隨著病情加重，稀糞呈暗紅或微黃色，直至變?yōu)樗畼狱S白色。病程中期，患鵝表現為厭食、飲水增加、羽毛逆亂且無光澤、站立不穩(wěn)，病情嚴重的鵝質量明顯減輕。病程后期患鵝嚴重脫水、迅速消瘦、翅膀下垂，多數呈癱瘓狀，多排綠色糞便，直至衰竭死亡。瀕死期的患鵝體溫下降、食欲廢絕、蹲地，對外界刺激反應遲鈍。部分死亡后的鵝表現神經癥狀，頭頸扭曲或昂頭，倒提從口中流出水樣黏液。

2.3大體剖檢病變

剖檢病死鵝可見口腔有大量黏液，氣管和支氣管環(huán)充血、出血，內有大量黏液。食道和腺胃交界處出血、潰瘍，食道黏膜附著的纖維性結痂塊呈灰白色或黃色；腺胃黏膜充血、出血、潰瘍；肌胃和腺胃交界處有出血斑點，肌胃角質層下充血、出血、潰瘍。十二指腸、空腸、回腸黏膜附有特征性的黃色纖維性結痂（圖1）；直腸泄殖腔黏膜出血、潰瘍，痂塊表面附著的膿汁樣分泌物呈灰白色、淡黃色；盲腸扁桃體出血、腫大、潰瘍，部分病鵝的盲腸黏膜也有淡黃色痂塊、潰瘍灶；胰腺黏膜充血、出血。部分病鵝的肝臟質地較硬、腫大、瘀血；膽囊擴張，充盈膽汁；脾臟瘀血、腫大，表面布滿灰白色壞死灶（圖2）；肺臟有不同程度的充血、出血；腎臟略腫大、色淡，輸尿管擴張，充滿白色尿酸鹽；胸腺、法氏囊萎縮；大腦和小腦充血、水腫。

2.4顯微病理變化

腎小管上皮嚴重顆粒變性，部分細胞壞死崩解（圖3）。肺組織廣泛性充血、出血（圖4）。胸腺髓質胸腺小體結構破壞，周圍上皮性網狀細胞、胸腺細胞數量減少（圖5）。肝細胞廣泛發(fā)生顆粒變性、渾濁腫脹（圖6）。脾紅髓部局部淋巴細胞數量減少，散布大量紅細胞（圖7）。十二指腸絨毛黏膜層、固有層局部壞死脫落（圖8）。回腸黏膜層、固有層有大量炎性細胞浸潤（圖9）。

2.5基因片段的擴增結果

電泳檢測結果顯示，NDV-F的條帶大小（圖10）與預期結果一致。

3結論與討論

病理組織學研究顯示，鵝副黏病毒可在肝臟、腎臟、脾臟、胰腺、腸道、胸腺等全身多種器官和組織中復制，并對其造成損傷，造成較為典型的顯微及大體病理變化。此外，鵝副黏病毒還能導致患鵝心肌纖維廣泛發(fā)生顆粒變性，并使氣管黏膜上皮細胞壞死脫落、固有層充血、毛細血管瘀血[5]，使大腦和小腦充血，法氏囊萎縮。可見，鵝副黏病毒是一種泛嗜性病毒，其泛嗜性是導致鵝副黏病毒病在臨床上具有較高發(fā)病率和病死率的主要原因。患鵝臨床表現出的消化系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等方面的癥狀，是由相應器官和組織發(fā)生病理變化所致，癥狀的輕重與病理變化的程度密切相關。

鵝副黏病毒病對各日齡鵝均有易感性，日齡越小則發(fā)病率和病死率越高，發(fā)病率和病死率均隨日齡的增長有所下降，2周齡以內雛鵝的發(fā)病率和病死率可達100%[6]。鵝副黏病毒對患鵝免疫系統(tǒng)的侵害比較嚴重，日齡越小的鵝其免疫系統(tǒng)發(fā)育越不成熟，自身免疫能力越低，感染后的發(fā)病率和病死率越高；日齡越大的鵝其免疫系統(tǒng)發(fā)育越成熟，免疫能力越強，感染后的發(fā)病率和病死率有所降低，發(fā)病后約7 d有可能逐漸痊愈康復。對小日齡鵝群加強飼養(yǎng)管理，嚴格執(zhí)行消毒措施，處理好患鵝所污染的飼料、飲水、墊草、墊料、用具，無害化處理死鵝、內臟、羽毛等，謹防該病通過消化道和呼吸道感染。

鵝副黏病毒屬于禽副黏病毒Ⅰ型F基因Ⅶ型毒株，與新城疫常用的弱毒苗、中等毒力苗的毒株基因型不同；因此，僅用這些疫苗進行免疫不能防治鵝副黏病毒病，只有選用經過基因鑒定的毒株制備滅活苗，才能有效預防本病的發(fā)生[7-8]。鵝場應制定科學合理的免疫程序，做好鵝群的免疫監(jiān)測工作，定期檢測鵝副黏病毒病的抗體（HI抗體）水平，做到科學免疫。遏制鵝副黏病毒病的發(fā)生和流行，必須采取綜合防治措施。雞群也能感染鵝副黏病毒病，因此鵝場須遠離雞場、村戶，鵝群內不飼養(yǎng)雞，避免相互傳播[5]。鵝群一旦發(fā)病應該立即隔離或淘汰病鵝，同時對假定健康鵝進行緊急免疫接種。

參考文獻：

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