干酪中微生物的研究進展

黃宜++劉振民++莫蓓紅

摘要：干酪是一種具有豐富營養物質的乳制品，隨著人們生活水平的提高，對干酪這種營養健康的食品需求量也會越來越大。干酪中的微生物在其生產和成熟過程中起著非常重要的作用，產生豐富的營養物質，同時也與干酪獨特的風味、質地以及功能性營養物質形成有關。主要介紹了微生物在干酪生產過程中的作用和污染微生物對干酪生產和成熟的影響。研究干酪與微生物的關系并控制污染微生物的生長，對干酪制作的質量控制具有重要意義。

關鍵詞：干酪；營養；微生物；污染

中圖分類號： TS252.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0359-03

干酪，又名奶酪，有各式各樣的味道、口感和形式。分為成熟或未成熟的軟質、半硬質、硬質或特硬質、有涂層的干酪。干酪以奶類為原料，含有豐富的蛋白質和脂質，具有很高營養價值[1]。隨著我國人民生活水平的提高，對像干酪這種營養健康食品的需求量越來越多。近10年來，我國干酪市場持續升溫，進口量不斷擴大。據海關信息網（www.haiguan.info）統計，我國干酪進口量從2004年的 7 244.1 t 增加到2013年的47 330.9 t，年平均增長率為23.2%，進口總數量超過20萬t。

在干酪生產和成熟過程中微生物菌群起著重要的作用，促進了產品質構和風味形成[2]。這些微生物主要包括發酵劑微生物和非發酵劑微生物。發酵劑微生物的作用在于干酪生產過程中產酸，用于提高凝乳酶的活性，有助于排除乳清和抑制有害菌生長。非發酵劑菌群主要是指乳酸菌[3]，在切達和荷蘭式干酪中最常見的是嗜溫乳桿菌，如干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、丙酸桿菌、彎曲乳桿菌。它們對干酪獨特風味和眼孔的形成以及增強微生物的生存能力具有重要作用。除了添加的發酵劑外，還存在著一些來自于生產和加工過程中混入的微生物，對干酪也有一定影響。干酪中微生物的特點是大量細菌、酵母和霉菌共存，且許多因素影響它們的生存與生長。

與發酵酸奶相比，由于干酪具有獨特的物理和化學特性，如更高的pH值、低滴定酸度、高緩沖能力、高脂肪高營養、低氧以及結構緊密。所以在乳制品中，干酪是益生菌進入人體腸道潛在的優良載體。為了保證干酪產品對人體的健康益處，菌群數量需要達到106 CFU/g以上且無不良感官性狀。因此，將益生菌[4]添加到不同種類的干酪中研究不同組分和加工方式等因素對干酪產品中益生菌的生存能力和感官特性的影響已經成為了研究熱點。干酪中益生菌穩定性的影響因素可以歸結為3個方面，包括處方因素（菌種及其交互作用，pH值和可滴定酸度，過氧化值，分子態氧，生產促進劑和食品添加劑、鹽、微膠囊化和成熟的因素）、加工因素（培養溫度、熱處理、接種的類型和儲存溫度）、包裝材料和系統方面。

1干酪中主要微生物菌群

1.1干酪中的發酵劑菌群

大多數干酪在生產過程中都需要添加發酵劑。在天然非霉菌干酪生產過程中，常添加乳酸菌（LAB）[5]。LAB為革蘭氏陽性菌[6]，過氧化氫酶呈陰性，無芽孢形成，低GbC含量且為兼性厭氧型。其形態特征能很好地表達這種細菌的非均質性，因為它們可能出現桿狀、球形，單細胞或耦合、四分，或長、短鏈。由于LAB有限的生物合成能力和碳源、氮源的高要求，是只能在營養豐富環境中生長的營養缺陷型菌株，需要一些氨基酸和維生素供其生長。LAB在干酪中是常用的發酵劑，由于它們的一些代謝特性，對干酪的感官、質地、營養價值和發酵食品的微生物安全性有著顯著影響。

發酵劑菌群主要是在干酪生產過程中產酸，同時對干酪成熟也起著一定推動作用。干酪生產過程中一個關鍵點是乳酸菌乳糖代謝為乳酸，酸化的速度和程度影響凝乳的效果和控鹽率。LAB能夠快速發酵乳糖產生高濃度乳酸，提高凝乳酶活性[7]。這些LAB包括中溫發酵劑乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和明串珠菌屬（Leuconostoc spp.），嗜熱發酵劑包括嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）和 瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）等。

1.2干酪中的非發酵劑菌群

干酪生產過程中非發酵劑菌群[8]對干酪的成熟發揮重要作用，可以使干酪的成熟時間縮短至幾個月或幾周。這些微生物能夠降解蛋白質和脂肪，加速蛋白質的次級水解進程，對干酪的風味和質地的形成極為重要[9]。常見的非發酵劑菌群通常包括腸球菌（Enterococcus）、乳酸桿菌（Lactobacillus）、乳酸乳球菌（Lactococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）、片球菌屬（Pediococcus）和鏈球菌（Streptococcus）等。

1.3微生物在干酪的食品安全性中的作用

現今，幾乎所有的食品中都會添加食品劑添加劑，各種各樣食品劑添加使用廣泛，導致人們對食品添加劑的危害性產生擔憂。干酪中乳酸菌在生產過程中能夠產生有機酸（丙酸、丁酸、醋酸等）降低環境的pH值，抑制有害微生物的生長[10]，對干酪中微生物穩定性提供保護作用，從而減少食源性致病菌和食品腐敗菌的生長和生存的風險。在干酪中乳酸菌的作用能夠替代食品添加劑，延遲食品貨架期[11]，且不會產生不利因素。

乳酸菌產生的細菌素[12]是一類具有活性的多肽或蛋白質物質，抑菌范圍不局限于同源性微生物，且產生菌自身有免疫作用。產生細菌素使乳酸菌具有重要的生物保鮮能力，即所謂的“生物保藏”，是指使用微生物和其代謝物加強和提高食品的安全性和保質期。有研究發現，細菌糞腸球菌在干酪成熟過程中表現出比其他的NSLAB菌株產生更持久的細菌素能力，能夠有效抑制真菌污染物的生長代謝和次級代謝產物。此外，蛋白質和脂肪分解能力強的菌株可以有效抑制致病菌（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）的生長，對李斯特菌[13]也有一定抑制作用。

2微生物對干酪品質的影響

2.1干酪風味的產生

干酪的風味是非常復雜的，涉及數百種化合物，是在微生物產生的多種酶共同作用下形成的[14]。成熟過程中發生生化變化，初次變化包括糖酵解、脂肪、蛋白質水解，形成獨特的初級風味物質，從而產生揮發性香氣化合物的前體，然后通過二次生化變化，如脂肪酸和氨基酸的代謝形成重要的次生代謝產物，包括風味形成所必需的一些化合物的代謝。分解代謝反應和側鏈修飾可能會產生酮酸、氨、胺、醛、酸和醇等，形成了干酪基本的味道和香氣。如切達干酪中，最為重要的物質有乙酸、丁酸、己酸、辛酸、硫化氫、谷氨酸、羰基化合物等，這些化合物的產生與生產過程中所用的發酵菌種有關。還有一些非揮發性化合物，乳游離氨基酸和肽與蛋白酶和肽酶水解系統有關[15]。因此，干酪的風味是一個多組分混合體系。

2.2干酪質地的形成

在干酪的熟化過程中，組織中的一系列結構成分會產生不同的物理化學變化過程。這些變化可以通過剩余的凝乳、微生物菌群和代謝產生的酶以及在礦物質平衡上的變化來進行調節。其中包括：剩余的乳糖會轉變成乳酸、乙酸和丙酸；酪蛋白水解生成了很多種氨基酸和縮氨酸，并且氨基酸會通過轉化形成胺、乙醇、乙醛和NH3；甘油三酯通過水合作用生成游離脂肪酸，進一步降解后生成酮和乙醇；脂肪球的凝結會導致脂肪槽的形成，在所有類型的干酪中都有發生；通過改善副酪蛋白的水合作用，如其水解性、干酪的pH值升高和酪蛋白連接鈣的溶解性。

因此，干酪是極其復雜的體系，包含了化學、生物和生化學等多方面變化，如酪蛋白水解水合、組織的膨脹、脂肪的凝結和水解，都會使干酪的質地發生一系列變化。干酪的質地性質包括基本性質、二級性質和三級性質。二級性質和三級性質是對干酪基本性質的延伸。基本性質包括組成、微觀結構和宏觀結構以及它的分子性質。二級和三級性質還包括許多其他的性質，如彈性、硬度、脆性和柔軟度，這些特性和內在的流變特性是直接相關的。這些流變學特性決定了干酪在受外力咬、擠壓、咀嚼、磨碎過程中的變化。由于干酪的質地受流變學特性的影響，因此它們的關系是很密切的[16]。

2.3益生菌功能性營養物質

益生菌定義為“活的微生物，當達到足夠的數量會賦予人體健康的益處”。益生菌影響人體健康，是通過改善腸道菌群的平衡，改善黏膜對病原體的防御。額外的健康益處包括增強免疫反應、降低血清膽固醇、維生素合成、抗癌活性、抗菌活性。從營養學的角度來看，干酪含有豐富的營養物質，如蛋白質、維生素、礦物質和短鏈脂肪酸，是健康飲食重要的部分[17]。其中，維護骨骼健康的鈣和人體必需的氨基酸非常豐富，其組成對肌肉結構的發展不可缺少，這些因素都導致了醫療衛生機構鼓勵干酪的消費。此外，在干酪成熟過程中，來自于牛奶、發酵劑和次級微生物菌群中的蛋白酶和肽酶將酪蛋白水解成了很多肽類。部分肽類在結構上類似于內源性肽、激素、神經遞質或抗生素，在有機體中發揮了至關重要的作用。它們中的一些也可以在腸胃消化道中不被消化掉或作為最終的前體肽的形式存在。在受體相同的情況下，部分肽的衍生物比內源性肽有更強的相互作用，能在有機體中發揮激動或拮抗作用。

3干酪中的主要污染微生物對干酪的影響

3.1噬菌體對干酪生產過程的影響

在很多干酪生產過程中，乳業工廠在熱處理的牛奶中添加微生物發酵劑控制發酵過程。這些對噬菌體敏感的高濃度菌群在干酪工廠中是無處不在的。噬菌體能夠通過空氣循環傳播并且在干酪生產設施中也是普遍存在的。化學食品和生物技術產品是通過大規模的微生物發酵制成的。因為大量的微生物細胞是在發酵罐中培養的，大部分工業都經歷過噬菌體污染的問題[19]。噬菌體的大量產生一直是工業的困擾，因為它們能減速發酵過程且對產品質量不利，會導致額外的花費和延時。乳品行業幾十年來一直都在努力控制噬菌體的量。

乳品工業根據選擇的發酵劑菌種大量生產發酵乳制品。例如，乳酸鏈球菌的幾個菌株被廣泛用于牛奶生產干酪中。發酵劑的菌群量在大型工業發酵罐中能夠高達109 CFU/mL。噬菌體在乳品環境中普遍存在，若發酵劑中對噬菌體敏感的宿主細胞占優勢，任何一個發酵罐中的烈性噬菌體都會開始感染，使得它的繁殖體最終會溶解大量的發酵劑細胞，并且會減速發酵過程，從而使產品質量低劣。現今，控制食品中噬菌體的量已經取得了重大進展，由于已經有了一些方法將噬菌體控制在低水平上。例如，一個標準的干酪生產工廠將幾株乳酸鏈球菌循環使用來阻止噬菌體的積累。盡管如此，在制作干酪過程中噬菌體感染使得生產過程一直具有相當大的風險，因為噬菌體菌群會時時進化且通過多種途徑擴散。噬菌體的來源和它們的分散途徑必須要有清晰的認識，單一的處理措施難以限制它們的增殖。

因此，抗噬菌體發酵劑的研究一直都是當今研究的熱點，在乳制品行業具有巨大的發展潛力。將生物工程和基因工程相結合，研究細菌的噬菌體抗性機理，為研發抗噬菌體菌株的育種提供了良好的前景。

3.2梭狀芽孢桿菌對干酪的影響

干酪產氣只有在成熟晚期才明顯發生。這是由于梭狀芽孢桿發酵乳酸產生丁酸、乙酸、二氧化碳和大量氫氣所致。這是半硬質和硬質干酪變質的主要原因之一，導致干酪外觀、質構和風味出現瑕疵。Clostridium tyrobutyricum為革蘭氏陽性菌，厭氧，是能夠產生孢子的細菌，被認為是奶酪晚期產氣[20]的首要原因。然而，發現其他的梭菌菌種，如Clostridium sporogenes、Clostridium beijerinckii和 Clostridium butyricum也會使干酪出現這種顯著的瑕疵[21]。

晚期產氣最常見的控制方法是通過對牛乳進行離心除菌和微過濾，添加硝酸鹽或溶菌酶。然而，通過離心除菌，孢子的減少數量還不足以減少干酪中晚期產氣。相對于離心除菌減少95%的孢子，微過濾能減少達到99%，但只適用于脫脂牛奶，因為牛奶的脂肪球過大，無法通過微濾膜。另外，減少晚期產氣的方法是在干酪生產工程中使用乳酸菌（LAB）細菌素。乳酸菌細菌素能夠有效抑制梭狀芽孢桿菌的生長，常用于再制干酪中。添加溶菌酶或添加NO3-也能夠有效減少干酪晚期產氣，對不同的菌種具有不一樣的效果。歐洲食品安全局（EFSA）建議盡量減少使用硝酸鹽和亞硝酸鹽作為食品添加劑的使用，是為了保持潛在的致癌物質亞硝胺保持在低的水平。通常情況下是結合幾種方法，最優化控制干酪中的晚期產氣。

4結語

干酪是一種既營養又健康的高蛋白食品，是全人類飲食文化中不可缺少的一部分，具有廣闊的前景。近十幾年來，干酪作為食品配料的使用量增加迅速，主要用在面包、漢堡、披薩等西式食品中。隨著我國對外交流的加強，西方飲食文化逐漸滲入到我國人民的日常生活之中，人們對干酪的認識逐漸加深。干酪具有豐富的營養價值和出色的功能特性，必將被國內越來越多的消費者接受。干酪中微生物的菌種和數量一直處于動態變化中，所起的作用無可替代，不僅加工工藝會對微生物產生影響，生產過程中其所產生的物質和干酪中的營養物質也會對其產生影響。我國干酪的研究工作起步較晚，與國際還有較大差距。研究微生物與干酪的作用關系、改善生產工藝具有廣闊的前景。

參考文獻：

[1]Karimi R，Sohrabvandi S，Mortazavian A M. Review article：sensory characteristics of probiotic cheese[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety，2012，11（5）：437-452.

[2]Fitzsimons N A，Cogan T M，Condon S，et al. Phenotypic and genotypic characterization of non-starter lactic acid bacteria in mature cheddar cheese[J]. Applied and Environmental Microbiology，1999，65（8）：3418-3426.

[3]Karimi R，Mortazavian A M，da Cruz A G. Viability of probiotic microorganisms in cheese during production and storage：a review[J]. Dairy Science & Technology，2011，91（3）：283-308.

[4]Kieronczyk A，Skeie S，Langsrud T，et al. Cooperation between Lactococcus lactis and nonstarter Lactobacilli in the formation of cheese aroma from amino acids[J]. Applied and Environmental Microbiology，2003，69（2）：734-739.

[5]Feutry F，Oneca M，Berthier F，et al. Biodiversity and growth dynamics of lactic acid bacteria in artisanal PDO Ossau-Iraty cheeses made from raw ewes milk with different starters[J]. Food Microbiology，2012，29（1）：33-42.

[6]Ayad E H. Starter culture development for improving safety and quality of Domiati cheese[J]. Food Microbiology，2009，26（5）：533-541.

[7]Burns P，Cuffia F，Milesi M，et al. Technological and probiotic role of adjunct cultures of non-starter lactobacilli in soft cheeses[J]. Food Microbiology，2012，30（1）：45-50.

[8]Settanni L，Moschetti G. Non-starter lactic acid bacteria used to improve cheese quality and provide health benefits[J]. Food Microbiology，2010，27（6）：691-697.

[9]Speranza B，Sinigaglia M，Corbo M R. Non starter lactic acid bacteria biofilms：a means to control the growth of Listeria monocytogenes in soft cheese[J]. Food Control，2009，20（11）：1063-1067.

[10]Settanni L，Franciosi E，Cavazza A A，et al. Extension of tosela cheese shelf-life using non-starter lactic acid bacteria[J]. Food Microbiology，2011，28（5）：883-890.

[11]Alegría A，Delgado S，Roces C，et al. Bacteriocins produced by wild Lactococcus lactis strains isolated from traditional，starter-free cheeses made of raw milk[J]. International Journal of Food Microbiology，2010，143（1/2）：61-66.

[12]dal Bello B，Cocolin L，Zeppa G，et al. Technological characterization of bacteriocin producing Lactococcus lactis strains employed to control Listeria monocytogenes in cottage cheese[J]. International Journal of Food Microbiology，2012，153（1/2）：58-65.

[13]Callon C，Saubusse M，Didienne R，et al. Simplification of a complex microbial antilisterial consortium to evaluate the contribution of its flora in uncooked pressed cheese[J]. International Journal of Food Microbiology，2011，145（2/3）：379-389.

[14]Pappa E C，Massouras T，Sotirakoglou K A. Formation of volatile compounds in Teleme cheese manufactured with mesophilic and thermophilic dairy starters[J]. Small Ruminant Research，2013，111（1/3）：110-119.

[15]Dimitrov Z. Characterization of bioactive peptides with calcium-binding activity released by specially designed cheese starter[J]. Biotechnology and Biotechnological Equipment，2009，23（S1）：927-930.

[16]Charlet M，Duboz G，Faurie F，et al. Multiple interactions between Streptococcus thermophilus，Lactobacillus helveticus and Lactobacillus delbrueckii strongly affect their growth kinetics during the making of hard cooked cheeses[J]. International Journal of Food Microbiology，2009，131（1）：10-19.

[17]Fortin M H，Champagne C P，St-Gelais D A，et al. Effect of time of inoculation，starter addition，oxygen level and salting on the viability of probiotic cultures during Cheddar cheese production[J]. International Dairy Journal，2011，21（2）：75-82.

[18]Verreault D，Gendron L，Rousseau G M，et al. Detection of airborne lactococcal bacteriophages in cheese manufacturing plants[J]. Applied and Environmental Microbiology，2011，77（2）：491-497.

[19]Carmen Martinez-Cuesta M，Bengoechea J，Bustos I A，et al. Control of late blowing in cheese by adding lacticin 3147-producing Lactococcus lactis IFPL 3593 to the starter[J]. International Dairy Journal，2010，20（1）：18-24.

[20]Garde S，Gaya P，Arias R，et al. Enhanced PFGE protocol to study the genomic diversity of Clostridium spp. isolated from Manchego cheeses with late blowing defect[J]. Food Control，2012，28（2）：392-399.

[21]Garde S，Arias R，Gaya P，et al. Occurrence of Clostridium spp. in ovine milk and manchego cheese with late blowing defect：identification and characterization of isolates[J]. International Dairy Journal，2011，21（4）：272-278.周紅宇，楊德. 茶皂素水酶法提取工藝及純化方法[J]. 江蘇農業科學，2016，44（5）：362-364.