高效煙堿降解菌A4發酵條件優化

李俊剛++姜立春++馬家俊

摘要：為了提高煙堿降解菌A4降解煙堿的能力，采用單因素試驗和正交試驗法對菌株A4發酵條件進行了優化。結果表明，通過單因素試驗確定了影響菌株A4生長的培養基主要因素為pH值、煙堿含量、碳源、氮源；采用4個因素3個水平進行正交分析，確定了發酵的最佳條件為：在培養溫度為30 ℃、pH值7.0、煙堿含量2.0 g/L、接種量 5.0%、檸檬酸三鈉0.3%、胰蛋白胨1.5%條件下，培養48 h，其煙堿降解率為72.8%比優化前提高了22.5%。結果為采用生物技術降解煙堿廢棄物以及改善煙葉品質方面提供了良好的菌種資源。

關鍵詞：煙堿；煙堿降解菌；生物降解；條件優化；正交試驗

中圖分類號： TS41+4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0431-04

煙堿（nicotine）又名尼古丁，是煙草生物堿的主要成分，占煙草生物堿的95%以上，是影響煙葉品質的重要因素之一[1-2]。一般來講，煙堿含量高的煙葉，煙氣勁頭大，反之則小。煙堿含量較高的煙葉可利用性比較差，傳統物理和化學方法降解煙堿不僅會影響環境，甚至對人類造成危害。利用微生物降解煙堿含量不僅高效，而且具有一定的選擇性，可用于降解煙草中煙堿和環境中被煙堿污染的廢棄物，對香煙品質不會產生不利的影響，并滿足消費群體對低煙堿卷煙的需求[3-6]。

目前，國內外已有報道篩選分離出一些煙堿降解菌株[7-8]，這些微生物可以在煙草工業和處理煙草廢棄物中發揮重要作用。Tashiro等從44個含有煙堿的土壤和廢水取樣中獲得57種細菌，這些細菌都呈短棒狀，用煙堿作為唯一碳氮源，在2周內能降解濃度為1.0 g/L的煙堿[9]。孔雯等從湖北省襄陽市煙草種植地中分離得到1 株煙堿降解菌，初步確定為煙堿節桿菌屬（Arthrobacter sp.），該菌在煙堿質量濃度為4 g/L的培養基中培養48 h后煙堿降解率達71% 以上[10]。2005年，阮愛東等篩選出1株假單胞菌（Pseudomonas sp. HF-1），該菌在培養基中培養25 h，煙堿濃度為1.3 g/L，測得煙堿降解率為99.6%[11]。袁勇軍等從福建三明煙區的土壤中分離得到一種菌，經過鑒定屬于為中間蒼白桿菌，該菌36 h降解了9756% 的煙堿，當煙堿的濃度低于2 g/L時，菌株能完全降解煙堿[12]。本研究從川渝中煙工業公司四川公司綿陽分廠的垃圾堆廢棄煙渣中篩選后獲得優良降解煙堿菌株A4，研究了不同煙堿濃度和不同培養條件下該菌株對煙堿的降解能力，旨在為降低煙葉煙堿含量、提高煙葉可用性等提供理論依據。1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株節桿菌屬A4菌株，本課題組從川渝中煙工業公司四川公司綿陽分廠的垃圾堆廢棄煙渣中篩選后獲得的優良降解煙堿菌株，經形態鑒定、生理生化特性測定和16S rRNA系統分析，初步鑒定為節桿菌屬，保存于綿陽師范學院微生物實驗室。

1.1.2煙堿培養基K2HPO4 13.3 g，KH2PO4 4.0 g，酵母提取物1.0 g，微量元素溶液10 mL，加蒸餾水至1 000 mL，pH值70，培養基經121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后，加入一定量煙堿（用0.22 μm濾膜過濾），固體煙堿培養基添加2.0%瓊脂[4]。

1.1.3微量元素溶液MnSO4·7H2O 0.4 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，FeSO4·7H2O 0.2 g 使用0.1 mol/L HCl定容至100 mL[5]。

1.2主要試劑與儀器

煙堿含量≥98%，宜陽縣天成生化有限責任公司；WFZ-UV-2000紫外分光光度儀，SC-3610低速離心機，KYC-100C恒溫氣浴式振蕩器，Sanyo高壓蒸汽滅菌鍋，YT-CJ-1N超凈工作臺等。

1.3方法

1.3.1菌懸液的制備接種1環A4菌到裝有10 mL煙堿液體培養基的試管中，于28 ℃下150 r/min培養48 h。再將這 2 mL 菌懸液接種到100 mL液體培養基中，在相同條件下培養48 h。

1.3.2煙堿含量測定將純化菌株接入煙堿培養基中，于30 ℃、150 r/min 搖床培養，以未接菌的煙堿培養基為空白對照。發酵液于8 000 r/min離心20 min，上清液用0.05 mol/L HCl溶液稀釋至合適的吸光度范圍。以0.05 mol/L HCl溶液為參比，進行全波長掃描，測得煙堿最大吸收波長為260 nm，在此波長下計算煙堿降解率：煙堿降解率=（初始培養液中煙堿含量-發酵液中煙堿含量）/初始培養液中煙堿含量×100%。

1.3.3單因素試驗對A4菌株初始pH值、培養時間、煙堿濃度、接種量、培養溫度等發酵條件進行單因素優化。分別設置發酵培養基中5、6、7、8、9的不同初始pH值；20、25、30、35、40 ℃的不同培養溫度；6、12、18、24、48、72 h不同培養時間；0.1、0.5、1.0、2.0、3.0 g/L的不同煙堿濃度；0.5%、1.0%、20%、3.0%、5.0%、8.0%的不同接種量。120 r/min搖床培養48 h后測定培養液中煙堿的吸光度，測得不同單因素條件下的煙堿降解率，每個因素設置3個平行，取平均值。

1.3.4不同培養基組分對菌株降解煙堿的影響分別以含量為2.0 g/L的萄葡糖、蔗糖、檸檬酸三鈉、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉等碳源添加培養基中，用于篩選最適碳源[13]；分別以含量為10 g/L的胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硝酸銨、氯化銨等氮源添加培養基中，用于篩選最適氮源。

1.3.5正交試驗為確定最適合煙堿降解條件，根據單因素試驗結果，選擇對降解煙堿影響較大的4個因素，即A：pH值；B：煙堿濃度；C：檸檬酸三鈉；D：胰蛋白胨，設計了4個因素3個水平的正交試驗L9（34），以煙堿降解率為指標進行試驗（表1），確定復合因素對菌株A4降解煙堿的影響。

2結果與分析

2.1煙堿標準曲線繪制

分別吸取煙堿質量濃度為1.0 g/L的工作液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，用濃度為0.05 mol/L的鹽酸溶液定容到50 mL，稀釋至0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012、0.014 mg/mL。用同濃度的鹽酸溶液做參比，在此波長下測量不同濃度煙堿的吸光值，以煙堿濃度為橫坐標，吸光度為坐標軸繪制煙堿含量標準曲線（圖1）。吸光值（y）與煙堿含量（x）呈現良好的線性關系，回歸方程為y=38.929x-0.008 2，相關系數r=0.999 3。

2.2單因素培養條件優化

2.2.1不同pH值對菌株降解煙堿的影響在初始pH 值不同的條件下，在150 r/min、30 ℃下振蕩培養72 h，試驗結果見圖2。結果表明，在pH值為6.0～7.5時，菌株降解煙堿的效果比較好。當pH值為7.0時，降解效果最好，其降解率達 27.5%；而pH值<6.0或>8.0時菌株降解煙堿的能力下降較快。通常認為培養基中的氫離子和氫氧根離子間接的對微生物產生影響，起初作用于胞外可解離的弱酸或弱堿，容易形成透過細胞膜的游離態進入胞內，再作用于參與代謝的各種酶類，從而影響菌體的生長和酶的合成，進而影響菌株A4對煙堿的降解率[14]。因此，煙堿降解菌A4的最適降解pH值為7. 0。

2.2.2不同培養時間對菌株降解煙堿的影響在培養時間不同的條件下，在150 r/min、pH值為7.0、溫度為30 ℃條件下振蕩培養72 h，每隔6 h取樣測煙堿濃度1次，試驗結果見圖3。結果表明，煙堿濃度隨菌株培養時間的延長而降低，其降解率逐漸升高；在48 h時，培養液中煙堿濃度僅為 1.27 g/L，其降解率達36.5%，此后隨著培養時間的延長，其煙堿降解率變化不大。因此，選擇48 h為菌株最適培養時間。

2.2.3不同煙堿濃度對菌株降解煙堿的影響在培養基中煙堿濃度不同的條件下，在150 r/min、pH值為7.0、溫度為30 ℃條件下振蕩培養48 h，結果表明，當煙堿質量濃度為0.1～2.0 g/L 時，隨著濃度的升高，煙堿降解效率逐漸升高；在濃度為2.0 g/L時，其降解率最高，為35.8%。當濃度高于 2.0 g/L 時，煙堿降解率迅速下降，當濃度達到3.0 g/L時，其降解率最低，為13.3%（圖4），這可能由于高濃度煙堿對細胞具有毒害作用，抑制了其生長從而影響了對煙堿的降解。因此，煙堿降解菌A4最適初始煙堿濃度為2.0 g/L。

2.2.4不同接種量對菌株降解煙堿的影響在培養基中接種量不同的條件下，在150 r/min、pH值為7.0、溫度為30 ℃條件下振蕩培養48 h，結果表明，隨著接種量的升高，其煙堿降解率也逐漸增高，當接入量為0.5%～5.0%時，隨接入量的增加，降解率上升較快，但接入量高于5.0%時降解率趨于平穩（圖5）。因此，選擇5.0%作為最適接種量。

2.2.5不同培養溫度對菌株降解煙堿的影響在培養基中培養溫度不同的條件下，在150 r/min、pH值為7.0、接種量為5.0%條件下振蕩培養48 h，結果表明，溫度過低或過高對煙堿的降解都有較大影響，在溫度為25～35 ℃，菌株降解效果較好，在30 ℃時降解率達到最高，為54.2%（圖6）。因此，選擇 30 ℃ 作為最適培養溫度。

2.3培養基成分優化

2.3.1不同碳源對菌株降解煙堿的影響在基礎培養基中改用了不同碳源，考察不同碳源對菌株A4降解煙堿的影響，碳源是不可缺少的重要元素之一，不同的碳源會影響微生物的生長和降解酶的合成。從圖7可以看出，A4菌株降解率隨著培養液中添加的碳源不同其降解率也隨之改變。當培養液中添加檸檬酸三鈉為碳源時，菌株的降解率最大，為46.1%，且對煙堿降解影響較大。當培養液中分別添加乳糖、麥芽糖、蔗糖和淀粉作為碳源時，A4菌株的降解率依次為23.3%、30.2%、26.5%和26.3%，其中以葡萄糖作為碳源時的降解率最低，為21.5%。因此，選擇檸檬酸三鈉作為最適碳源。

2.3.2不同氮源對菌株降解煙堿的影響在基礎培養基中改用了不同氮源，考察不同氮源對菌株A4降解煙堿的影響。從圖8可以看出，A4菌株降解率隨著培養液中添加的氮源不同其降解率也隨之改變。當培養液中添加胰蛋白胨作為氮源時，菌株的降解率最大，為50.3%，當培養液中分別添加牛肉膏、酵母粉和氯化銨作為氮源時，A4菌株的降解率依次為40.3%、48.8%、31.2%，其中以硝酸銨作為氮源時的降解率最低，為23.2%，表明該菌株不能很好地利用無機氮源。因此，選擇胰蛋白胨作為最適碳源。

2.4正交試驗

為了更好地提高煙堿降解率，本研究選擇了影響煙堿降解較大的4個因素，即pH值、煙堿濃度、檸檬酸三鈉和胰蛋白胨含量，進行3個水平的正交試驗，以進一步提高煙堿降解率。在不同條件下，以降解率為指標分析煙堿降解條件，結果見表2。由極值R值可知，不同因素對試驗結果的影響依次為：B>A>C>D；從方差分析可看出，因素B的主效應很顯著，即煙堿濃度對菌株降解效率有較大影響，其次是pH值和檸檬酸三鈉，最后為胰蛋白胨（表3）。綜合各種因素得出，4個因素正交試驗降解煙堿適宜條件最優水平組合為A2B2C3D3，即：pH值為7.0，煙堿濃度為2.0 g/L，檸檬酸三鈉濃度為0.3%，胰蛋白胨含量為1.5%（表2）。

2.5驗證試驗

為了驗證試驗結果的準確性，依據正交試驗優化得到的最適培養基組成進行試驗。3個平行試驗結果表明，經過正交優化培養基后煙堿降解率為72.8%，比優化前50.3%提高了44.7%，可見優化后的培養基能明顯提高菌株A4對煙堿的降解能力。

3結論

通過以煙堿降解率為指標的單因素和正交試驗，確定A4菌株的最優煙堿降解方案：即pH值7.0、接種量5.0%、檸檬酸三鈉含量0.3%、胰蛋白胨含量1.5%、煙堿含量2.0 g/L，溫度30 ℃、150 r/min搖床培養，以上述優化組合培養48 h后測定培養液中煙堿的吸光度，其煙堿降解率達到72.8%，同單因素培養條件下的降解率50.3%相比，提高了44.7%，優化后的組合有明顯的降解優勢。該試驗結果表明，煙堿降解菌A4 對煙堿具有較強的代謝降解能力，這將為利用生物技術降解煙堿廢棄物和降低煙葉中煙堿含量提供良好的菌種資源。

參考文獻：

[1]周淑平，肖強，陳葉君，等. 不同生態地區初烤煙葉中重要致香物質的分析[J]. 中國煙草學報，2004，10（1）：9-16.

[2]Davis D L，Nielsen M T.煙草——生產，化學和技術[M]. 北京：化學工業出版社，2003：7-11.

[3]唐綱嶺，劉惠民，李榮，等. 固相微萃取/氣相色譜/質譜法定性定量分析煙葉中香味物質的研究[J]. 中國煙草學報，2002，8（3）：1-10.

[4]Wang S N，Liu Z，Xu P. Biodegradation of nicotine by a newly isolated Agrobacterium sp. strain S33[J]. Journal of Applied Microbiology，2009，107（3）：838-847.

[5]Treiber N，Schulz G E. Structure of 2，6-dihydroxypyridine 3-hydroxylase from a nicotine-degrading pathway[J]. Journal of Molecular Biology，2008，379（1）：94-104.

[6]Wang H H，Yin B，Peng X X，et al. Biodegradation of nicotine by newly isolated Pseudomonas sp. CS3 and its metabolites[J]. Journal of Applied Microbiology，2012，112（2）：258-268.

[7]唐遠駒，張建平. 上海主要烤煙生產基地質量生態類型的初步劃分[J]. 中國煙草科學，2006，27（3）：1-5.

[8]萬虎，趙海剛，宋紀真，等. 高濃度煙堿降解菌的篩選、鑒定及降解特性[J]. 煙草科技，2009（4）：50-53，64.

[9]Tashiro A，Yuji K，Yonemura C，et al. Pure isolation of nicotine-degrading microbes[J]. Kyushu Kyoritsu Daigaku Kenkyu Hokoku，1996，20：147-155.

[10]孔雯，先鋒，李長影，等. 1株煙堿降解菌的篩選、鑒定及其降解性能的初步研究[J]. 華中農業大學學報，2011，30（1）：30-33.

[11]Ruan A D，Min H，Peng X H，et al. Isolation and characterization of Pseudomonas sp. strain HF-1，capable of degrading nicotine[J]. Research in Microbiology，2005，156（5/6）：700-706.

[12]袁勇軍，陸兆新，黃麗金，等. 煙堿降解細菌的分離、鑒定及其降解性能的初步研究[J]. 微生物學報，2005，45（2）：181-184.

[13]Yuan Y J，Lu Z X，Huang L J，et al. Biodegradation of nicotine from tobacco waste extract by Ochrobactrum intermedium DN2[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2007，34（8）：567-570.

[14]司靜，崔寶凱，戴玉成. 栓孔菌屬漆酶高產菌株的初步篩選及其產酶條件的優化[J]. 微生物學通報，2011，38（3）：405-416.黃周滿，牛雯婧. 秸稈/污泥制備活性炭及處理生活污水效果[J]. 江蘇農業科學，2016，44（5）：435-437.