接種枯草芽孢桿菌和叢枝菌根真菌促進紅三葉修復石油污染土壤

王麗麗++楊謙

摘要：在溫室內通過盆栽試驗的方法，比較對照組（CK）、單純接種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，簡稱Bs）、單純接種叢枝菌根真菌——地球囊霉（Glomus geosporum，簡稱Gg）、混合接種Gg+Bs的紅三葉種植于石油污染的土壤中后，植株與土壤理化性狀差異。實驗結果表明，經過60 d修復后，與對照組相比，單純或混合接種處理均能顯著增加紅三葉地上和地下干生物量（P<0.05），可溶性糖含量和脯氨酸含量均顯著升高（P<0.05），葉片CAT、POD活性顯著升高（P<0.05），丙二醛含量明顯減少（P<0.05）。在各種接種處理中，紅三葉根際與非根際土壤脫氫酶活性和土壤中總石油烴降解率均顯著升高（P<0.05）。Bs和Gg在紅三葉修復石油污染土壤和植物抗石油脅迫的能力方面有協同作用，接種Bs+Gg處理修復效果要優于單獨接種Bs或Gg。

關鍵詞：枯草芽孢桿菌；叢枝菌根真菌；紅三葉；石油污染；土壤修復

中圖分類號： X53文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）05-0526-03

通信作者：楊謙，教授，博士生導師，主要從事環境微生物方面的研究。E-mail：yangq@hit.edu.cn。石油污染土壤的修復與治理已經成為當前亟待解決的問題。植物修復技術是降解修復石油污染土壤的一種有效手段，選擇適宜油污區生長的綠色植物是實現植物修復的前提條件。植物-微生物修復系統作為農業生態環境保護領域具有價值和廣闊前景的新型技術，不僅能促進土壤中石油污染物的降解和礦化，也能有效提高植物對石油類和其他有機污染物的修復效率。植物根際促生細菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）和叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza fungi，AMF）是植物根際微生物的重要組成部分，二者都能加速土壤養分循環，增強污染物的降解能力，可以改善植物根際微生物和土壤酶活性，提高植物對逆境的抗御能力[1-7]。PGPR 和AMF既可通過促進植物的生長促進彼此在植物根際的繁衍，同時也存在對營養和生態位的競爭[8]。紅三葉（Trifolium pratense）是一種抗逆性較強的天然牧草，具有發達的根系，對重金屬、干旱、養分脅迫等逆境條件表現出不同的響應[9-11]。然而，紅三葉對石油污染土壤的修復效果的報道還很少，有關枯草芽孢桿菌與地球囊霉對紅三葉修復石油污染土壤效果的影響尚不明確。在前期的研究中，我們篩選出了一株根際枯草芽孢桿菌，該菌株對原油具有一定的降解能力。本研究結果可為利用PGPR和AMF強化植物原位修復降解大慶石油生產區域石油污染土壤提供理論依據。

1材料和方法

1.1材料

采用受石油污染土壤（黑龍江省大慶市臥里屯草甸土）作為供試基質，其主要理化性質為：pH值（土 ∶水=1 ∶2.5）8.09，有機質35.7 g/kg，全氮含量2.75 g/kg，全磷含量 3.28 g/kg，全鉀含量18.8 g/kg，總石油烴含量75.24 g/kg。采集的土壤經風干，過2 mm網篩后，在105 ℃下濕熱滅菌2 h。土壤過篩時并未發現有土著AM真菌。供試植物為紅三葉（Trifolium pratense），將紅三葉種子在10% NaClO中浸泡10 min，然后用無菌去離子水沖洗數次，而后置于濕潤的濾紙上進行催芽處理。供試PGPR菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，以下簡稱Bs），由本實驗室從問荊（Equisetum arvense）分離，保存在-80 ℃。在室溫條件下將Bs接種在TSB液體培養基[12]、28 ℃下振蕩培養24 h，用無菌水洗后，在4 ℃、4 000 r/min 條件下離心2次后重懸浮于無菌雙蒸餾水中，用無菌水調整PGPR菌懸液濃度為 5×109 CFU/mL。供試AMF菌為地球囊霉（Glomus geosporum，以下簡稱Gg），由本實驗室從雙穗雀稗（Paspalum distichum）根際土壤中分離，保存在-80 ℃。使用時Gg預先經紅三葉草盆栽繁殖，試驗使用的菌劑是含有孢子、根外菌絲和被侵染植物根段的根際土壤混合物，每克菌劑中含有25～35個孢子。

1.2試驗設計

試驗在溫室內進行，采用盆栽紅三葉草接種不同菌種，共設置4個處理，分別為：（1）對照組（CK）（僅種植植物，未對植物進行任何接種處理），（2）單獨接種PGPR（Bs），（3）單獨接種AMF（Gg），（4）PGPR和AMF混合接種（Gg+Bs）。

盆栽塑料花盆高度30 cm，盆口內直徑30 cm，盆底內直徑20 cm，裝土前在花盆內套上塑料袋，防止污染物隨水流失，每盆裝基質3 kg。將菌根真菌Gg接種劑與供試土壤按質量比1 ∶20的比例（約150 g）混勻散撒在種子下約2 cm處的土壤中；不接種處理的則加入等量滅活的菌根真菌Gg菌劑，以保持土壤理化性質與微生物區系的一致性。Bs接種處理是將經表面消毒處理過的紅三葉用PGPR菌體懸浮液浸種0.5 h，未接種PGPR處理種子用無菌雙蒸餾水浸種0.5 h。每處理設置4個重復，隨機排列。

生長期間維持溫度在（25±5） ℃，光照時間為14 h/d，每天7至21時用生物鏑燈補充光照。待各盆出苗齊全后間苗，每盆留50株。植物生長期間用稱質量法澆水，苗期每天按基質質量的10%澆水，植株生長出現差異后，隔2 d稱質量一次并按土質量的20%補給，確保盆內水不外溢，土壤含水量保持在75%左右。

紅三葉草生長60 d后收割，將根系清洗干凈后，選取1 cm 長的新鮮根段用曲利本藍染色法染色[13]，制作切片，然后在光學顯微鏡下采用網格交叉計數法統計菌根侵染率。將鮮葉清洗干凈后，稱取5.0 g植株鮮葉片測定有關生理指標；并且對紅三葉的地下和地上部分烘干后測定生物量。同時測定紅三葉草根際和非根際土壤的脫氫酶活性和總石油烴含量，計算土壤中總石油烴降解率。

1.3測定項目

紅三葉生物量采用烘干法測定，即將收獲后的植株洗凈瀝干在105 ℃下殺青30 min，70 ℃下烘干至恒質量，用電子天平稱量植株地上和地下生物量。游離脯氨酸（Pro）含量采用茚三酮顯色法[14]測定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[14]（TBA）測定；過氧化物酶（POD）活性采用愈創木酚法測定[14]；過氧化氫酶（CAT）活性采用H2O2還原法測定[14]；可溶性糖測定采用蒽酮比色法[14]；土壤脫氫酶活性采用TTC比色法[15]；土壤中總石油烴含量測定采用質量法。

1.4統計分析

試驗數據以x±s表示，運用SPSS 17.0軟件對試驗數據進行統計分析。

2結果與分析

2.1不同接種處理對紅三葉草根侵染率和生物量的影響

不同接種處理對在石油污染土壤中生長的紅三葉草根侵染率和生物量存在很大差異（表1）。對照組（CK）和接種Bs處理紅三葉草根部侵染率均為0，接種Gg的紅三葉草根部的侵染率為1.58，接種Gg+Bs處理紅三葉草根部侵染率達到3.32。Gg、Gg+Bs處理與對照組相比紅三葉草菌根侵染率有顯著增加（P<0.05）。接種處理后紅三葉草的生物量（地上和地下）與對照組相比均顯著增大（P<0.05），表明接種Bs、Gg可以提高紅三葉草的生物量積累來緩解石油污染對紅三葉草生長帶來的不利影響。方差分析表明，Gg和Bs之間存在顯著交互效應（P<0.05），主要表現在接種Gg+Bs處理協同促進紅三葉生長，增加生物量，表明混合接種處理對于提高紅三葉在石油污染土壤中的生長和修復能力有重要意義。

2.2不同接種處理對紅三葉草植株生理指標的影響

2.2.1不同接種處理對紅三葉草葉片可溶性糖含量的影響不同接種處理后紅三葉草植株葉片可溶性糖含量都有一定幅度升高（表2）。在石油污染土壤條件下，接種Bs、Gg處理的紅三葉草植株葉片中可溶性糖含量與對照組相比較顯著升高（P<0.05），這說明單獨接種Bs或Gg可以使紅三葉草葉片可溶性糖含量增加。接種Gg+Bs處理的紅三葉植株葉片可溶性糖明顯高于對照組（P<0.05），方差分析表明，Gg和Bs之間存在顯著交互作用效應（P<0.05），主要表現在接種Gg+Bs處理協同促進紅三葉植株可溶性糖的積累。

2.2.2不同接種處理對紅三葉草葉片脯氨酸含量的影響由表2可見，石油污染土壤條件下，接種Bs、Gg處理的紅三葉植株脯氨酸含量顯著高于對照組（P<0.05），Gg+Bs處理脯氨酸含量比Gg、Bs處理均顯著升高（P<0.05）。說明Bs與Gg之間存在顯著的交互作用效應，接種Bs+Gg對于提高石油污染脅迫下紅三葉植株中脯氨酸含量有協同作用。

2.2.3不同接種處理對紅三葉草葉片丙二醛含量的影響各接種處理的紅三葉的MDA含量都表現出降低的趨勢（表2）。與對照組相比較，接種Bs、Gg處理紅三葉葉片MDA含量顯著降低（P<0.05），Gg+Bs處理紅三葉葉片MDA含量顯著降低（P<0.05）。Gg和Bs混合接種處理對紅三葉葉片MDA含量有顯著協同效應。

2.2.4不同接種處理對紅三葉草葉片POD活性的影響在石油污染土壤中，各接種處理后紅三葉葉片POD活性都呈升高的趨勢（表2），Bs、Gg、Gg+Bs處理后紅三葉葉片POD活性與對照組相比顯著升高（P<0.05），Gg+Bs處理最高。這說明Gg、Bs對紅三葉植株葉片POD活性均有促進作用。

2.2.5不同接種處理對紅三葉草葉片CAT活性的影響由表2可知，與對照組相比較，Bs、Gg、Gg+Bs處理能顯著提高石油污染土壤生長的紅三葉植株葉片CAT活性（P<0.05），Gg+Bs處理最大。Bs與Gg之間有顯著的交互作用（P<005），表現為Gg+Bs處理協同提高石油污染土壤紅三葉植株葉片的CAT活性。

2.3不同接種處理對石油污染土壤的脫氫酶活性和總石油烴含量的影響

不同接種處理的紅三葉根際和非根際土中脫氫酶和總石油烴含量的變化如圖1所示。相同處理的紅三葉根際和非根際土之間的脫氫酶活性存在差異，呈現出紅三葉非根際土脫氫酶活性普遍低于根際土脫氫酶的趨勢。各接種處理紅三葉根際和非根際土壤的脫氫酶活性均顯著高于對照組（P<005），Bs+Gg處理的土壤脫氫酶活性最高，表現出顯著的協同作用（P<0.05）。

不同接種處理對石油污染土壤總石油烴降解率如圖2所示。對照組土壤中總石油烴的平均降解率為5.55%，接種處理的土壤中總石油烴含量顯著降低（P<0.05），各接種處理中紅三葉根際土的總石油烴降解率均高于其非根際土總石油烴降解率。Gg+Bs處理土壤總石油烴平均降解率達到2339%，接種Gg+Bs處理對土壤總石油烴的降解效果顯著強于Gg、Bs處理（P<0.05）， 表明混合接種Bs和Gg對紅三葉降解石油污染土壤總石油烴具有協同增效作用。

3討論

一般認為，植物體內通過一些滲透物質（如可溶性糖、脯氨酸等）的調節來防御逆境脅迫引起的不利影響[16]。在石油污染土壤中生長的植株，植物的呼吸和蒸騰作用受到影響，破壞了細胞膜結構，造成細胞內電解質的外滲，因而對植物產生一定的毒害作用，嚴重抑制植物的生長[17-19]。以往的研究表明通過接種PGPR和AMF可以增強逆境脅迫下植物的生長能力和抗逆性。本研究表明接種根際促生細菌Bacillus subtilis和菌根真菌地球囊霉Glomus geosporum能顯著提高石油污染土壤中紅三葉植株中可溶性糖、脯氨酸含量和生物量，對由于石油污染引起的紅三葉的滲透脅迫起到保護作用，提高紅三葉對石油污染脅迫的耐受性。丙二醛是活性氧啟動膜脂過氧化的主要產物，其含量的高低和細胞質膜的透性變化是反映膜脂過氧化作用強弱和質膜破壞程度的重要指標[20]。在逆境脅迫下，植株的生長發育受到抑制，丙二醛含量會嚴重降低。在本試驗中，我們發現接種促生細菌Bacillus subtilis和菌根真菌Glomus geosporum可以降低紅三葉植株丙二醛含量的積累，表明促生細菌Bacillus subtilis和Glomus geosporum協同作用可以有效提高紅三葉對石油污染脅迫的耐受性。接種PGPR和接種GM處理的紅三葉葉片POD、CAT活性顯著升高，增強了紅三葉對活性氧的清除能力，降低膜脂過氧化程度，這為提高紅三葉修復石油污染提供了一道生理屏障。

AM菌與根際促生菌假單胞菌屬（Pseudomonas）和枯草芽孢桿菌屬（Bacillus）等細菌[21]有相互促進作用，可以改善植物根際微生物和土壤酶活性，增強污染物的降解能力。Kohler等認為接種PGPR、AM真菌和溶磷菌處理的萵苣（Lactuca sativa）根際土壤酶活性顯著高于非接種處理[22-23]。本試驗認為，接種處理可以顯著提高土壤脫氫酶的活性，表明不同接種處理的紅三葉對石油污染土壤中總石油烴的降解能力存在差異。真菌、細菌可以協同作用對石油污染土壤進行修復，其生長及對石油烴的降解不受土著微生物的抑制。單獨接種地球囊霉、摩西球囊霉以及混接AM真菌、細菌能顯著提高柴油的降解率[24]。本試驗研究表明單獨和混合接種Bacillus subtilis和Glomus geosporum都能顯著促進石油污染土壤中總石油烴降解能力，由此可見，接種Bacillus subtilis和菌根真菌Glomus geosporum是提高紅三葉修復石油污染土壤的有效技術手段。

4結論

接種Bacillus subtilis和Glomus geosporum處理均能顯著提高紅三葉地上和地下干生物量、可溶性糖含量和脯氨酸含量（P<0.05），葉片CAT、POD活性顯著升高（P<0.05），丙二醛含量明顯減少（P<0.05）。在各接種處理中，紅三葉根際與非根際土壤脫氫酶活性和土壤中總石油烴降解率均顯著升高（P<0.05）。接種Bs+Gg處理修復效果要優于單獨接種Bs或Gg，Bs和Gg在紅三葉修復石油污染土壤和植物抗石油脅迫的能力方面有協同作用。

參考文獻：

[1]耿春女，李培軍，陳素華，等. 不同AM真菌對三葉草耐油性的影響[J]. 應用與環境生物學報，2002，8（6）：648-652.

[2]Arshad M，Shaharoona B，Mahmood T. Inoculation with plant growth promoting rhizobacteria containing ACC-deaminase partially eliminates the effects of water stress on growth，yield and ripening of Pisum sativum L.[J]. Pedosphere，2008，18（5）：611-620

[3]趙碩偉，沈嘉澍，沈標.復合菌群的構建及其對石油污染土壤修復的研究[J]. 農業環境科學學報，2011，30（8）：1567-1572.

[4]Huang X D，El-Alawi Y，Gurska J，et al. A multi-process phytoremediation system for decontamination of persistent total petroleum hydrocarbons （TPHs） from soils[J]. Microchemical Journal，2005，81：139-147.

[5]Hong S H，Ryu H W，Kim J，et al. Rhizoremediation of diesel-contaminated soil using the plant growth-promoting rhizobacterium Gordonia sp. S2RP-17[J]. Biodegradation，2011，22：593-601.

[6]龍偉文，王平，馮新梅，等. PGPR與AMF相互關系的研究進展[J]. 應用生態學報，2000，11（2）：311-314.

[7]秦芳玲，田中民. 同時接種解磷細菌與叢枝菌根真菌對低磷土壤紅三葉草養分利用的影響[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2009，37（6）：151-157.

[8]張瑞芹，盧致霖，陳潔雯，等. AM真菌影響三葉草根系抗氧化酶活性的系統效應[J]. 微生物學通報，2011，38（3）：322-327.

[9]張穎，高景慧.鎘脅迫對紅三葉種子萌發及幼苗生理特性的影響[J]. 西北農業學報，2007，16（3）：57-59.

[10]何瑋，蔣安，王琳，等. PEG 干旱脅迫對紅三葉抗性生理生化指標的影響研究[J]. 中國農學通報，2013，29（5）：5-10.

[11]孔令慧，趙桂琴. 不同品種紅三葉苗期對4 ℃低溫脅迫的生理響應[J]. 中國草地學報，2013，35（3）：31-37.

[12]吉云秀. 含ACC脫氨酶PGPR分離及提高植物抗逆性[D]. 大連：大連海事大學，2008.

[13]Phillips J M，Hayman D S.Improved procedures for clearingand staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizalfungi for rapid assessment of infection[J]. Trans Br Mycol Soc，1970，55：158-161.

[14]李玲. 植物生理學實驗指導[M]. 北京：科學出版社，2009：10-11.

[15]劉光崧. 土壤理化分析與剖面描述[M]. 北京：中國標準出版社，1996.

[16]簡令成，王紅. 逆境植物細胞生物學[M]. 北京：科學出版社，2009.

[17]何潔，賀鑫.石油對翅堿蓬生長及生理特性的影響[J]. 農業環境科學學報 2011，30（4）：650-655.

[18]岳冰冰，李鑫，任芳菲，等. 石油污染對紫花苜蓿部分生理指標的影響[J]. 草業科學，2011，28（2）：236-240.

[19]李小利，劉國彬. 土壤石油污染對植物苗期生長和土壤呼吸的影響[J]. 水土保持學報，2007，21（3）：95-98.

[20]張金林，李惠茹，郭姝媛，等. 高等植物適應鹽逆境研究進展[J]. 草業學報，2015，24（12）：220-236.

[21]Linderman R G. Role of VAM fungi in biocontrol[M]//Pfleger F L，Linderman R G. Mycorrhizae and plant health.St Paul，MN：APS Press，1994：1-26.

[22]Kohler J，Hernández J A，Caravaca F，et al. Induction of antioxidant enzymes is involved in the greater effectiveness of a PGPR versus AM fungi with respect to increasing the tolerance of lettuce to severe salt stress[J]. Environmental and Experimental Botany，2009，65：245-252.

[23]Kohler J，Caravaca F，Carrasco L，et al. Interactions between a plant growth-promoting rhizobacterium，an AM fungus and a phosphate-solubilising fungus in the rhizosphere of Lactuca sativa[J]. Applied Soil Ecology，2007，35：480-487.

[24]耿春女，李培軍，陳素華，等. 不同叢枝菌根真菌對萬壽菊生長及柴油降解率的影響[J]. 應用生態學報，2003，14（10）：1775-1779.孫凱文，時佩佩，盛海君，等. 富營養化水體中磷濃度對不同種類浮萍生長的影響[J]. 江蘇農業科學，2016，44（5）：529-531.