黏著斑激酶相關(guān)非激酶在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)及意義

王朝陽 吳文藝 朱世澤 楊維群 蔡玉梅 潘明孟 周仙穎 林新恭

[摘要]目的：探討?zhàn)ぶ呒っ赶嚓P(guān)非激酶（facol adhesion kinase-ralated nonkinase，F(xiàn)RNK）在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)及意義。方法：利用Western-blot及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-PCR，RT-PCR）檢測10例瘢痕疙瘩及10例相應(yīng)周圍正常皮膚組織中FRNK蛋白及mRNA表達(dá)水平并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：瘢痕疙瘩組織中的FRNK蛋白表達(dá)明顯低于正常皮膚（0.12±0.06比0.32±0.04），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；瘢痕疙瘩組織中FRNK mRNA表達(dá)明顯低于正常皮膚（0.27±0.03比1.10±0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：FRNK蛋白及mRNA在瘢痕疙瘩組織中低表達(dá)，導(dǎo)致其對成纖維細(xì)胞凋亡作用減弱，對瘢痕疙瘩的形成可能起重要作用，通過調(diào)節(jié)FRNK的表達(dá)，有望為瘢痕的治療提供新的靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞]黏著斑激酶相關(guān)非激酶（FRNK）；瘢痕疙瘩；成纖維細(xì)胞；凋亡

[中圖分類號(hào)]R619⁺.6 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2016）04-0038-03

瘢痕疙瘩的病理生理特點(diǎn)是大量的成纖維細(xì)胞（fibroblasts，F(xiàn)Bs）增生并伴凋亡障礙，氨基多糖和膠原在細(xì)胞外基質(zhì)（extracelluar matrix，ECM）中過度異常沉積，膠原纖維排列紊亂。FBs是瘢痕疙瘩形成的效應(yīng)細(xì)胞，也是膠原的主要來源，多種細(xì)胞因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及基因如Fas基因、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growthfactor-β，TGF-β）、類胰島素一號(hào)增長因子等通過調(diào)節(jié)FBs代謝、轉(zhuǎn)化、增殖、凋亡來促進(jìn)瘢痕形成。黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）是一種位于胞漿中的非受體酪氨酸蛋白激酶，處于整合素、生長因子等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的交匯點(diǎn)，在介導(dǎo)細(xì)胞粘附、遷移、侵襲及增殖等過程中起著重要的作用，而且FAK的主要磷酸化部位，對調(diào)節(jié)FAK的活性起關(guān)鍵作用。黏著斑激酶相關(guān)非激酶（facol adhesio-n kinase-ralated nonkinase，F(xiàn)RNK）是FAK單獨(dú)表達(dá)的c末端結(jié)構(gòu)域，但由于其缺乏FAK的激酶區(qū)，可以內(nèi)源性的抑制FAK活性，F(xiàn)RNK同時(shí)可以負(fù)向調(diào)節(jié)黏著斑信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，達(dá)到抑制FAK的酪氨酸磷酸化的目的。近年來隨著對瘢痕的深入研究，已經(jīng)明確多種因素影響瘢痕的形成和發(fā)展，但目前尚未有明確關(guān)于FRNK與瘢痕疙瘩關(guān)系的研究。筆者采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-PCR，RT-PCR）和Western blot，分別從mRNA和蛋白水平檢測FRNK在瘢痕疙瘩中的表達(dá)，探討其在瘢痕疙瘩形成中的作用，為瘢痕的防治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1標(biāo)本來源

選用2013年7月2014年10月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院整形外科手術(shù)切除的瘢痕疙瘩及周圍正常皮膚，取材部位為面部、胸背部、腹部或四肢等。由于受標(biāo)本例數(shù)限制，瘢痕疙瘩10例，其中，男4例，女6例，年齡2～55歲，平均（30.00±18.83）歲，病程6～24月，平均（13.70±6.31）月，病因：外傷4例，手術(shù)3例，穿耳孔1例，感染2例。各標(biāo)本要求：所取標(biāo)本之患者無合并皮膚疾病、結(jié)締組織病和其它重要臟器器質(zhì)性疾病，局部皮膚無潰瘍及感染；所有標(biāo)本患者術(shù)前均未行放化療、激光及免疫治療，并經(jīng)過患者同意切取；所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。

1.2主要試劑和儀器

兔抗FRNK多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，DNA凝膠回收試劑盒購自TIANGEN公司，RNA提取試劑Trizol購自日本TAKARA公司，RT-PCR試劑購自德國DBI公司，DEPC及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Sigma公司，RNasin購自美國Promega公司，HRP Goat anti-Rabbit IgG購自BOSTER，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自PierceTM，Annexin V/PIapoptosis kit購自杭州聯(lián)科生物公司，裂解液購自碧云天公司，ABl9700PCR擴(kuò)增儀、ABl310型DNA測序儀購自美國ABI公司，Stratagene Mx3000P Real time PCR儀購自美國Agilent公司。

1.3 Western Blotting檢測

應(yīng)用Western blot檢測10例瘢痕疙瘩及10例相應(yīng)周圍正常皮膚組織中FRNK蛋白的表達(dá)。每例標(biāo)本取3g，將組織剪切成細(xì)小的碎片（組織直徑1mm）。按照每20mg組織加入150 u l裂解液的比例加入裂解液。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。12000 r/min，4℃離心5min，收集上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的BCA法蛋白定量試劑盒測定各樣品總蛋白含量。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入適當(dāng)稀釋的一抗、二抗（一抗稀釋倍數(shù)為1 000倍，二抗稀釋倍數(shù)為5000倍），ECL化學(xué)發(fā)光法檢測顯影。底片通過凝膠灰度分析軟件Quantity One

4.6.2進(jìn)行灰度值定量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 RT-PCR檢測

RT PCR檢測FRNK基因的表達(dá)情況：Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，分別抽提正常皮膚及瘢痕疙瘩組織，每組的總的RNA，調(diào)整RNA為1mg/1，以GAPDH為內(nèi)參對照，進(jìn)行RT PCR檢測。引物合成：從Genbank中檢索出基因序列，根據(jù)生物信息學(xué)的分析設(shè)計(jì)Real time PCR檢測引物。FRNK引物序列為：上游引物GTTGGATCCGTCA GAACTGTGTACAATACTGGAGGAGG-3下游引物5-CTCGAATTCCAACAGACAGATGAAACCTTCCCTC-3；內(nèi)參GAPDH引物序列為：上游引物5CAGCCTCAAGATCATCAGCA3，下游5TGTGGTCATGAGTCCTTCCA3。循環(huán)條件：預(yù)變性94℃5min，變性94℃ 30s，退火（P70s6k為59℃；4E-BP1為61℃）30s，延伸72℃ 1min，循環(huán)35次，終延伸72℃5min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察，拍照并進(jìn)行分析，其代表數(shù)值為平均灰度值，代表相應(yīng)基因的表達(dá)量，并除以GAPDH的平均灰度值，所得數(shù)值作為各擴(kuò)增產(chǎn)物的mRNA相對表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

RT PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2^-ΔΔCt法進(jìn)行相對表達(dá)量分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）描述，利用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析（One way ANOVA），P<0.05表示為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 FRNK蛋白的表達(dá)情況

Western-blot測定結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩中FRNK蛋白相對表達(dá)量為0.12±0.06，呈低表達(dá)，正常皮膚為0.32±0.04，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1、圖1）。

2.2 FRNK mRNA的表達(dá)情況

RT PCR檢測顯示瘢痕疙瘩中FRNK mRNA相對表達(dá)量為0.27±0.03，呈低表達(dá)，正常皮膚為1.10±0.05，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（表1、圖2）。

3討論

瘢痕疙瘩由于其形成機(jī)理復(fù)雜，一直都是整形外科的難點(diǎn)。FRNK與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系因此，瘢痕疙瘩作為腫瘤相關(guān)性疾病，其形成發(fā)展與FRNK的關(guān)系值得深入研究。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和WesternBlotting實(shí)驗(yàn)手段，深入剖析FRNK與瘢痕疙瘩的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，F(xiàn)RNK的mRNA水平在瘢痕疙瘩中呈低表達(dá)，在正常皮膚呈高表達(dá)，這與在Western Blotting實(shí)驗(yàn)中所得出的結(jié)論相一致。因此，F(xiàn)RNK基因的異常表達(dá)可能是瘢痕疙瘩形成的一個(gè)重要原因。FAK主要分布在胞質(zhì)，作為信號(hào)分子，處于細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的交匯點(diǎn)，介導(dǎo)細(xì)胞與ECM黏附，特別是對整合素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。整合素與ECM結(jié)合，導(dǎo)致FAK從細(xì)胞內(nèi)移至細(xì)胞膜上，并與整合素β1相結(jié)合，發(fā)生自身磷酸化，激活下游信號(hào)分子，導(dǎo)致一系列生物化學(xué)效應(yīng)。活化后的FAK通過多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖、遷移、分化、凋亡等多種生物學(xué)行為。Hayashida T等證實(shí)了FAK磷酸化激活ERK MAPK信號(hào)通路，導(dǎo)致腎系膜細(xì)胞纖維變能力增強(qiáng)。因此抑制FAK磷酸化能夠降低細(xì)胞纖維化形成。FRNK是FAK的C-末端結(jié)構(gòu)域單獨(dú)表達(dá)的一種缺乏激酶區(qū)的蛋白，可作為FAK的一種內(nèi)源性抑制因子，且能抑制FAK的酪氨酸磷酸化，參與FAK功能的負(fù)向調(diào)節(jié)。Oiang Ding等證實(shí)了小鼠特發(fā)性肺纖維化中FRNK表達(dá)下降，F(xiàn)RNK的缺損導(dǎo)致TGF-β信號(hào)放大，進(jìn)而導(dǎo)致了纖維細(xì)胞遷移、肌成纖維細(xì)胞分化和信號(hào)蛋白的活化。FRNK能夠抑制TGF-β介導(dǎo)的反應(yīng)。TGF-β是多效性的細(xì)胞因子，促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞形成。有研究發(fā)現(xiàn)FRNK能使肝星狀細(xì)胞總膠原和I型膠原合成能力降低。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了瘢痕疙瘩組織中FRNK蛋白和mRNA水平較正常皮膚少，結(jié)合瘢痕疙瘩的病理特點(diǎn)，筆者推測其FRNK表達(dá)減少能夠?qū)е麓龠M(jìn)成纖維細(xì)胞細(xì)胞凋亡作用減弱，瘢痕疙瘩組織中成纖維細(xì)胞細(xì)胞異常增殖分化，凋亡減少，導(dǎo)致病理性瘢痕的形成。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FRNK在瘢痕疙瘩中呈低表達(dá)，引起包括成纖維細(xì)胞在內(nèi)的組織修復(fù)細(xì)胞凋亡減少，異常增殖分化，形成病理性瘢痕。故通過干預(yù)FRNK表達(dá)水平，從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡，抑制增殖，預(yù)計(jì)將是較好的預(yù)防和治療瘢痕策略，可能具有良好的應(yīng)用前景，有望為瘢痕的治療提供新的靶點(diǎn)，為臨床治療瘢痕疙瘩提供新的方向。

編輯/張惠娟