慢性給予皮質酮對小鼠抑郁樣行為和突觸素的影響

孫秀萍，楊久山，徐艷峰，徐玉環，宋銘晶，秦　川

(1. 北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類動物模型三級實驗室，北京　100021；2. 山東中醫藥大學附屬醫院，濟南　250014)

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慢性給予皮質酮對小鼠抑郁樣行為和突觸素的影響

孫秀萍1，楊久山2，徐艷峰1，徐玉環1，宋銘晶1，秦川1

(1. 北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類動物模型三級實驗室，北京100021；2. 山東中醫藥大學附屬醫院，濟南250014)

【摘要】目的通過飲入方式，慢性給予皮質酮，觀察皮質酮對動物抑郁樣行為和海馬突觸素的影響。 方法 c57雄性小鼠隨機分為正常組和皮質酮組，每組10只。皮質酮組飲用含皮質酮的0.45%羥丙基-β-環糊精溶液，5 mg/kg/d。正常組動物給予0.45%羥丙基-β-環糊精溶液。造模35 d后，進行行為學實驗。行為學實驗結束后，動物灌注固定，應用免疫組化方法，檢測突觸素-1的表達。結果糖水偏愛測試結果表明，正常組和皮質酮組糖水偏愛指數無顯著性差異(P >0.05)。強迫游泳實驗結果表明，皮質酮組強迫游泳不動時間顯著延長(P < 0.05)。空場實驗結果顯示，正常組和皮質酮組總路程和速度無顯著性差異。皮質酮組中央區停留時間、路程及進入中央區頻次減少，邊緣區停留時間增加(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.01，P< 0.01)。新奇抑制攝食實驗結果表明，皮質酮組攝食潛伏期顯著延長(P < 0.05)，5 min內攝食量無變化。免疫組化結果顯示，皮質酮組突觸素-1表達顯著下降(P < 0.05)。結論通過飲入方式，慢性給予皮質酮，動物出現抑郁樣表現，可能與海馬突觸素-1表達減少，神經突觸傳遞效能降低有關。

【關鍵詞】皮質酮；抑郁；突觸素；小鼠

應激生活事件是抑郁癥發生發展的重要外因，海馬是應激損傷的敏感區[1]。外源性的應激會引起下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamus-pitutary-adrenal，HPA)負反饋失調，促使體內糖皮質激素釋放，通過一系列神經生化機制，導致海馬、前額皮層等受損，出現抑郁癥狀[2]。嚙齒類動物的糖皮質激素稱為皮質酮(corticosterone，CORT)。皮質酮抑郁模型即基于上述應激理論而形成的一種神經內分泌模型。通過皮下注射、飲入等方式，增加動物體內的皮質酮水平，模擬抑郁癥患者的神經生物學變化，用于抑郁癥神經生化機制的研究[3]。近年來，神經突觸功能失調和結構受損成為抑郁癥病理基礎的研究熱點[4]。抗抑郁藥物可能通過調控突觸可塑性而非神經發生發揮抗抑郁作用[5]。突觸素(synapsin-1，Syn-1)位于突觸囊泡上，與突觸結構和功能關系密切，其表達的水平可有效地反映突觸的狀態和功能[6]。本研究通過飲入方式，給予小鼠皮質酮，觀察皮質酮對小鼠抑郁樣行為及海馬不同分區突觸素表達的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物

SPF級c57雄性小鼠，8周齡，體重23～25 g。由北京華阜康生物科技股份有限公司提供【SCXK(京)2014-0004】，本實驗在中國醫學科學院醫學實驗動物研究所行為學實驗室進行【SYXK(京)2014-0029】。動物自由進食進水，室內溫度：23～25℃，相對濕度：(55±10)%。維持12 h光照/12 h黑暗的晝夜節律。動物適應環境一周進行實驗。

1.2儀器

動物行為學視頻跟蹤系統(Noldus Information Technology，EthoVision XT，The Netherlands)

1.3實驗方法

動物隨機分為正常組和皮質酮組，每組10只。模型組動物皮質酮組參照文獻[7]，將皮質酮溶于0.45%羥丙基-β-環糊精溶液中，35 μg/mL/d(相當于5 mg/kg/d)，避光，動物在造模和行為學檢測期間連續飲用。正常組動物給予0.45%羥丙基-β-環糊精溶液。造模35 d后，進行行為學實驗。行為學實驗結束后，每組取3只動物，灌注固定，進行免疫組化檢測。

1.3.1糖水偏愛測試

根據文獻報道[8]，糖水偏愛測試方法分為訓練期和測試期。訓練期內，使動物適應蔗糖飲水，第一個24 h，給予動物兩瓶1%蔗糖水，第二個24 h，給予動物一瓶1%蔗糖水，一瓶純水。測試前不禁食禁水，測試期間，同樣給予動物一瓶1%蔗糖水，一瓶純水，測試時間為15 h。為避免位置偏愛影響因素，測試中間，將兩瓶位置互換。測試結束，計算糖水偏愛指數(糖水偏愛指數=糖水消耗/ 總液體消耗×100%)。

1.3.2空場實驗

根據報道，方形空場環境尺寸為50×50×30 cm(長×寬×高)。中央區是以方形空場對角線交點為中心，邊長20 cm的正方形區域，邊緣區寬8cm。將小鼠置于空場，觀察5 min 內動物的自發活動。實驗采用動物行為學視頻跟蹤系統(Noldus Information Technology，EthoVision XT，The Netherlands)，記錄動物的運動路程、速度及在各區的停留時間等。

1.3.3強迫游泳實驗

動物在測試房間適應1 h后，進行強迫游泳實驗。根據文獻[9]，將小鼠放入高20 cm，直徑12 cm，水深10 cm的圓形玻璃容器中，水溫25℃，觀察6 min，記錄后4 min的累計不動時間。判定不動的標準是動物在水中停止掙扎，呈漂浮狀態，僅有細小的肢體運動以保持頭部浮在水面。

1.3.4新奇抑制攝食實驗

根據Marcussen等[10]報道，采用方形敞箱(52×42×30 cm，長×寬×高)，中心放一食丸。小鼠在禁食(不禁水)24 h后，放入敞箱中，每次從同一方向、同一位置放入，記錄5 min內第一次攝食潛伏期(以開始咬食食丸為標準)，即動物自放入籠中至首次攝取食物的時間。

1.3.5免疫組化檢測

行為學實驗結束后，每組取3只動物，用10%水合氯醛麻醉，開胸，應用蠕動泵，灌注生理鹽水，再用4%多聚甲醛灌注固定，取腦。固定的腦組織，制備石蠟切片，脫蠟水化。微波爐加熱，進行抗原修復，PBS洗三次，羊血清封閉20 min。加入synapsin-1抗體(1∶1000)，4℃,過夜。加入二抗，室溫孵育30 min.。DAB顯色，二甲苯透明，封片。

1.4統計學處理

2結果

2.1皮質酮模型對糖水偏愛測試、強迫游泳實驗的影響

注：* P < 0.05，與正常組比較。圖1　皮質酮模型對糖水偏愛指數及強迫游泳不動時間的影響Note: * P<0.05， compared with the control group.Fig.1　Effect of CORT on the sucrose preference test and immobility time in the forced swim test in mice

注：* P < 0.05，** P < 0.01，與正常組比較。圖2　皮質酮模型對空場實驗的影響Note: * P < 0.05， ** P < 0.01，compared with the control group).Fig.2　Effect of CORT on the open field test in mice

如圖1A所示，皮質酮模型組糖水偏愛指數與正常組比較，無顯著性差異(P>0.05)。如圖1B所示，皮質酮模型組強迫游泳不動時間顯著延長，與正常組比較，具有顯著性差異(P< 0.05)。

2.2皮質酮模型對空場實驗的影響

如圖2A和2B所示，皮質酮模型組和正常組總路程無顯著性差異(P>0.05)。如圖2C、2D、2E和2F所示，皮質酮模型組中央區時間、路程及進入頻次顯著減少，邊緣區時間顯著延長，和正常組相比，具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01，P<0.01，P< 0.01)。2.3皮質酮模型對新奇抑制攝食的影響

如圖3A所示，皮質酮模型組攝食潛伏期顯著延長，與正常組比較，具有顯著性差異(P< 0.05)。如圖3B所示，皮質酮模型組和正常組5 min 內攝食量無顯著性差異(P>0.05)

注：* P < 0.05，與正常組比較。圖3　皮質酮模型對新奇抑制攝食實驗的影響Note: * P < 0.05， compared with the control group.Fig.1　Fig.3　Effect of CORT on novelty suppressed food test latency time

2.4皮質酮模型對海馬不同分區突觸素表達的影響

如圖4所示，突觸素陽性表達產物呈棕色顆粒，正常組動物海馬CA1區、DG區和CA3區棕色顆粒粗大密集、沉積成帶。皮質酮組棕色顆粒稀疏，突觸素表達顯著降低。

注：A、B：CA1區；C、D：DG區；E、F：CA3區；正常組：A、C、E；皮質酮組：B、D、F。圖4　皮質酮對海馬不同分區突觸素的影響(標尺=200 μm)Note：A、B：CA1；C、D：DG，E、F：CA3；Control group：A、C、E；CORT group：B、D、F.Fig.1　Fig.4　Effect of CORT on hippocampus Synapsin-1 expression(Bar=200 μm)

3討論

動物模型的轉化效度評價包括結構效度(construct validity)、預測效度(predictive validity)和表觀效度(face validity)三個層面[12]。結構效度指模型與某個假說理論的符合程度。皮質酮抑郁模型是通過皮下注射或飲入等方式，人為增加動物體內皮質酮水平，模擬抑郁癥神經生化機制的發生和發展過程，因此具有良好的結構效度。預測效度指治療藥物能有效干預動物模型的相應癥狀表現。已有研究表明丙咪嗪可縮短皮質酮損傷模型的強迫游泳不動時間，并逆轉皮質酮引起的海馬結構損傷，顯示該模型良好的預測效度[13]。表觀效度指動物模型中動物和人類之間癥狀學的相似性。該模型具有一定的抑郁癥行為學表型，但與傳統應激抑郁模型又有所不同。本研究結果顯示，皮質酮抑郁模型對動物的糖水偏愛測試沒有影響，這與文獻報道結果一致，即該模型并不能模擬抑郁癥的核心癥狀-快感缺失[14]。強迫游泳實驗是檢測抑郁模型及抗抑郁藥物藥效的另一個經典實驗，動物被迫在一個局限的空間游泳，首先試圖掙扎逃跑，隨后處于一種間歇性不動狀態，抑郁模型的強迫游泳不動時間延長，而抗抑郁藥物則能縮短動物的不動時間[15]。本研究結果表明，皮質酮模型小鼠強迫游泳的不動時間顯著延長。新奇抑制攝食實驗最初用于動物焦慮行為的評價，后來發現也可應用于動物抑郁行為及抗抑郁藥物的藥效學評價[16]。本實驗結果表明皮質酮可顯著延長動物的攝食潛伏期，5 min內動物攝食量與正常組相比無差異，提示皮質酮模型對動物的食欲沒有影響。強迫游泳實驗和新奇抑制攝食實驗提示皮質酮模型具有良好的表觀效度?？請鰧嶒炛?，皮質酮模型組運動路程和運動速度與對照組比較均無顯著性差異，說明該模型對動物的運動行為無影響。皮質酮和正常組在空場實驗的分區活動情況差異顯著，皮質酮模型組在邊緣區時間增加，而在中央區時間、路程及進入頻次減少，顯示其焦慮狀態。綜上，皮質酮模型小鼠具有抑郁癥模型的表觀效度，同時表現出焦慮行為。

突觸是神經元之間在功能上發生聯系的部位，也是信息傳遞的關鍵部位[17]。近年來，神經突觸傳遞效能降低，結構受損成為抑郁癥病理基礎的研究熱點。應激事件可激活HPA軸， 增加機體內皮質酮水平。皮質酮在高濃度下激活海馬等部位的糖皮質激素受體，改變突觸傳遞功能與可塑性的誘導，并導致區域特異性的腦區形態和結構上的改變，如神經棘突變短，突觸減少，從而影響情緒、學習記憶等認知功能[3]。突觸素-1(synapsin-1)作為突觸前軸索終末的特異性標記物, 是突觸結構及功能的標志之一, 可用來檢測突觸的密度和分布。本研究采用人為方式，增加小鼠體內皮質酮水平，免疫組化結果均顯示皮質酮模型組海馬的CA1、CA3、DG三個亞區均出現突觸素-1表達減少，提示高水平的皮質酮降低海馬神經元突觸的數量及功能，這與以往研究結果一致[3]。

綜上所述，通過飲入方式，人為增加動物體內皮質酮水平，可誘導動物的抑郁樣行為，而這種抑郁樣行為可能與海馬等腦區的突觸素表達減少，神經突觸傳遞效能降低有關

參考文獻：

[1]嚴璘璘. 慢性應激對海馬損傷的影響及其分子機制[J].神經解剖學雜志,2008，24(05)：556-559.

[2]Navarria, A., A. Tamburella, F. A. Iannotti，etal. The Dual Blocker of Faah/Trpv1N-Arachidonoylserotonin Reverses the Behavioral Despair Induced by Stress in Rats and Modulates the Hpa-Axis[J].Pharmacol Res, 2014,87 (2014) :151-159.

[3]Gourley, S. L., A. M. Swanson and A. J. Koleske. Corticosteroid-Induced Neural Remodeling Predicts Behavioral Vulnerability and Resilience[J].J Neurosci,2013，33(07)：3107-3112.

[4]陳偉恒, 陶長路, 時美玉，等. 突觸可塑性與腦疾病的神經發育基礎[J].生命科學,2014，(06)：583-592.

[5]Bessa, J. M., D. Ferreira, I. Melo，etal. The Mood-Improving Actions of Antidepressants Do Not Depend on Neurogenesis but Are Associated with Neuronal Remodeling[J].Mol Psychiatry,2009，14(08)：764-773.

[6]華冰, 程瑞鳳, 景晶，等. 甘草總黃酮抗大鼠應激抑郁作用及對突觸可塑性關鍵蛋白syp/Psd-95的調節作用[J].中國新藥雜志, 2014，23(10)：1180-1187.

[7]Le Dantec, Y., G. Hache, J. P. Guilloux，etal. Nrem Sleep Hypersomnia and Reduced Sleep/Wake Continuity in a Neuroendocrine Mouse Model of Anxiety/Depression Based on Chronic Corticosterone Administration[J].Neuroscience. 2014,274( 2014 ): 357-368.

[8]Pothion, Stéphanie, Jean-Charles Bizot,etal. Strain Differences in Sucrose Preference and in the Consequences of Unpredictable Chronic Mild Stress[J].Behavioural Brain Research,2004，155(01)：135-146.

[9]Kristen A. Stedenfeld, Sarah M. Clinton, Ilan A. Kerman，etal. Novelty-seeking behavior predicts vulnerability in a rodent model of depression [J]. Physiology & Behavior.2011，103(2011)：210 - 216.

[10]Castagne, V, P Moser, S Roux，etal. Rodent Models of Depression: Forced Swim and Tail Suspension Behavioral Despair Tests in Rats and Mice[J].Curr Protoc Neurosci,2011，2(08)：10-15.

[11]Marcussen, A. B., P. Flagstad, P. E. Kristjansen，etal. Increase in Neurogenesis and Behavioural Benefit after Chronic Fluoxetine Treatment in Wistar Rats[J].Acta Neurol Scand,2008，117(02)：94-100.

[12]孫秀萍, 張楠, 高杰，等. 慢性束縛應激模型致焦慮和抑郁共病的行為學研究[J].中國比較醫學雜志,2015，25(06)：18-22.[13]Crupi, R., E. Mazzon, A. Marino，etal. Melatonin Treatment Mimics the Antidepressant Action in Chronic Corticosterone-Treated Mice[J].J Pineal Res.2010，49(02)：123-129.

[14]Guilloux, J. P., M. Seney, N. Edgar，etal. Integrated Behavioral Z-Scoring Increases the Sensitivity and Reliability of Behavioral Phenotyping in Mice: Relevance to Emotionality and Sex[J].J Neurosci Methods,2011，197(01)：21-31.

[15]Micale, Vincenzo, Anna Arezzi, Liborio Rampello，etal. Melatonin Affects the Immobility Time of Rats in the Forced Swim Test: The Role of Serotonin Neurotransmission[J].European Neuropsychopharmacology,2006，16(07)：538-545.

[16]Stedenfeld, Kristen A., Sarah M. Clinton, Ilan A. Kerman，etal. Novelty-Seeking Behavior Predicts Vulnerability in a Rodent Model of Depression[J].Physiology & Behavior.2011，103(02)：210-216.

[17]Abush, H. and I. Akirav. Cannabinoids Ameliorate Impairments Induced by Chronic Stress to Synaptic Plasticity and Short-Term Memory[J].Neuropsychopharmacology,2013，38(08)：1521-1534.

〔修回日期〕2015-12-25

[基金項目]北京市自然科學基金資助項目(7142105)；國家自然青年科學基金項目(31301890)。

[作者簡介]孫秀萍(1974-)，女，博士， 研究方向：神經精神疾病藥理及方法學。

[通訊作者]秦川，教授，研究方向：神經疾病研究。

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2016) 01-0014-05

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.001.003

The effect of chronic corticosterone administration on depressive-like behaviour and synapsin-1 expression in mice

SUN Xiu-ping1, YANG Jiu-shan2,XU Yang-feng1,XU Yu-huan1,SONG Ming-jing1,QIN Chuan1

(1.Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College(PUMC)，and Institute of LaboratoryAnimal Science，Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)；Key Laboratory of Human DiseaseComparative Medicine，Ministry of Health；Key Laboratory of Human Disease Animal Models, State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China；2. Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250014,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of chronic corticosterone administration on depressive-like behaviour and synapsin-1 expression in mice. Methods C57BL/6J mice were randomly separated into 2 groups (n=10 per group): control and Corticosterone ( CORT). CORT was dissolved in vehicle (0.45%hydroxypropy-β-cyclodextrin, β-CD). Corticosterone (5mg/kg/day) was delivered for 35 days in drinking water and continued when the behavioral tests were performed. Control animals received vehicle(β-CD) in drinking water during the entire experiment. The behavior tests were applied to evaluate depressive-like behavior of the model. ResultsThe sucrose preference test showed no significant difference in sucrose intake between control and CORT group (P >0.05). The immobility time was increased in the forced swim test (P < 0.05). The cumulative duration，distance moved and frequency in the center area were decreased in the open field test(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.01). The cumulative duration in the border area was increased(P < 0.01). Latency to food was decreased in the novelty suppressed test(P < 0.05). Immunohistochemisty analysis showed a notably decreased expression of Syn-1 in the hippocampus CA1,CA3 and DG. ConclusionsChronic administration of CORT induced depressive-like behavior and decreased Syn-1 expression.

【Key words】Corticosterone； Depression；Synapsin-1； Mice