熒光定量PCR技術在肺結核診斷中的應用研究

王　霖　王　輝　李才信　瞿春燕　馬元肖

熒光定量PCR技術在肺結核診斷中的應用研究

王霖王輝李才信瞿春燕馬元肖

【摘要】目的探討熒光定量PCR技術在肺結核診斷中的應用價值。方法采用濃縮集菌涂片抗酸染色顯微鏡檢查、美國BD960型分枝桿菌培養儀進行結核菌快速培養鑒定、熒光定量PCR結核分枝桿菌檢測三種方法同時檢測1000例肺結核患者的痰液標本，比較檢測結果。結果PCR技術診斷陽性276例，陽性率27.6%（276/1000）；結核菌快速培養陽性252例，陽性率25.2%（252/1000）；涂片抗酸染色顯微鏡檢查172例，陽性率17.2%（172/1000），結核抗酸菌涂片陽性率低于PCR技術及快速培養法（P＜0.05），且熒光定量PCR技術與結核菌診斷金標準快速培養陽性符合率為91.3%（252/276）。結論熒光定量PCR技術檢測結核分枝桿菌DNA技術，對結核病進行診斷，與傳統的涂片、培養相比較，可提高肺結核診斷的敏感性、特異性和及時性，以期使肺結核患者得到早期診斷及有效治療。

【關鍵詞】熒光定量；PCR技術；肺結核；診斷；應用

Objective To investigate the value of real-time PCR technique in the diagnosis of pulmonary tuberculosis.Methods Tuberculosis acid-fast smear examination，culture and identification of TB rapid，quantitative PCR three methods simultaneously detect 1000 cases of tuberculosis patients sputum samples，comparing the detected results.Results PCR diagnostic technique positive 276 cases，the positive rate of 27.6%（276/1000）.Rapid TB culture positive 252 cases，the positive rate of 25.2%（252/1000）.Tuberculosis acid-fast smear examination 172 cases，the positive rate of 17.2%（172/1000），acid-fast bacilli smear-positive tuberculosis rate was much lower than PCR technique and rapid culture（P＜0.05），and quantitative PCR and rapid TB diagnostic gold standard culture positive rate was 91.3%（252/276）.Conclusion The fluorescence quantitative PCR detection of tuberculosis DNA technology can improve TB diagnostic sensitivity，specificity and timeliness，so that TB patients receive early diagnosis and effective treatment.

【Key words】Fluorescence quantitative，PCR technology，Tuberculosis，Diagnosis，Application

結核分枝桿菌的實驗室檢測是結核病診斷和治療轉歸確認的重要依據。提高實驗室檢測能力，促進早診斷、早治療是有效控制結核病蔓延的必要措施。目前臨床以集菌培養和涂片鏡檢法為主要的實驗室檢測手段［1］。大量研究表明傳統方法的培養周期長、檢出率低，難以滿足臨床需要。熒光定量PCR技術通過用一對結核分枝桿菌特異性引物和一條結核分枝桿菌特異性熒光探針，配以PCR反應液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，用PCR體外擴增法檢測結核分枝桿菌DNA，是一種重要的基因診斷技術，具有靈敏度高、特異性好、可定量、污染少，易于標準化、耗時短等優點［2］。本研究建立熒光定量PCR技術檢測結核分枝桿菌的方法，并對熒光定量PCR技術在臨床肺結核診斷和療效評估中的應用進行評價，以期使肺結核患者得到早期診斷及有效治療，為醫院增加經濟效益，讓患者和公眾受益，產生較好的社會效益和生態效益。

1　資料與方法

1.1樣本來源

收集2015年9月～2016年3月昆明市傳染病醫院的1000例疑似肺結核患者，年齡18～60歲，男635例，女365例。采集所有患者痰標本進行實驗檢測。

1.2方法

1.2.1儀器美國伯樂B?O-RADCFX96實時熒光定量PCR檢測儀，奧林巴斯顯微鏡，美國BDBACTECMG?T 960分枝桿菌/培養、鑒定、藥敏快速自動檢測系統。

1.2.2標本處理痰液中加入4倍體積的4%NaOH，搖勻，室溫下放置30 min左右液化，取1 ml～1.5 ml離心管中，12000 rpm離心5 min。去上清，沉淀加無菌生理鹽水1 ml打勻，12000 rpm離心5 min；再重復洗滌2次。沉淀直接加50μlDNA提取液充分混勻，提取液內含不溶于水的物質，取樣時需用加樣器充分混勻后吸取。如出現因吸頭嘴部太細不能吸取或取樣后堵塞吸頭的現象，可用潔凈無污染的剪刀將吸頭嘴部剪去一截）。金屬浴10 min（誤差不超過1 min）。12000 rpm離心5 min。

1.2.3檢測方法所有標本均采用濃縮集菌涂片抗酸染色顯微鏡檢查、結核菌快速培養鑒定、熒光定量PCR結核分枝桿菌檢測三種方法同時檢測。

結核涂片抗酸檢查：按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》要求常規操作［3］。

結核菌快速培養鑒定：痰標本經4%NaOH消化處理后接種培養瓶放入美國BD960型分枝桿菌培養儀進行結核菌快速培養鑒定；噻吩-2-羧酸肼（PNB）生長試驗進行分枝桿菌菌型鑒定，具體參照《結核病診斷實驗室檢驗規程》常規操作［4］。

熒光定量PCR測定：取單管單人份PCR反應管若干，直接加入處理后樣品或陰性物質2μl，8000 rpm離心數秒。將各反應管放入PCR儀，按下列條件擴增：93℃→2 min預變性，然后按93℃45 s→55℃120 s，共做30個循環后置33℃保溫。PCR反應后熒光監測，待各PCR管充分冷卻至33℃，迅速逐個將擴增后的反應管放入熒光檢測儀，讀取并記錄讀書A1。熒光激發波長為487 nm，檢測波長為525 nm。

質量控制：陰性質控品：增長的曲線不呈S型或Ct值為空白。陽性質控品：增長曲線呈S型，且強陽性質控品定量參考值在1×106基因拷貝/ml～2×107基因拷貝/ml，臨界陽性質控品定量參考值在2×102基因拷貝/ml～2×104基因拷貝/ml。

結果解釋：陰性結果判定：如果定量值＜5.000E+02，則實驗結果為陰性。陽性結果判定：如果定量值＞5.000E+02，則實驗結果為陽性。

1.3統計學處理

本研究所有數據處理采用SPSS 19.0軟件，計數資料以率表示，采用卡方校驗，P＜0.05時差異具有統計學意義。

2　結果

2.1熒光定量PCR技術與結核菌快速培養檢測結果比較

PCR技術診斷陽性276例，陽性率27.6%；結核菌快速培養陽性252例，陽性率25.2%，PCR技術診斷陽性率高于結核菌快速培養，數據差異具有統計學意義（χ2=5.675，P＜0.05），且PCR技術與快速培養陽性符合率為91.3%（252/276），見表1。

2.2熒光定量PCR技術與結核涂片抗酸檢查結果比較

PCR技術診斷陽性276例，陽性率27.6%；結核涂片抗酸檢查172例，陽性率17.2%。結核抗酸菌涂片陽性率低于PCR技術診斷陽性率，數據差異具有統計學意義（χ2=30.517，P＜0.05），且PCR技術與結核抗酸菌直接涂片法陽性符合率為62.3%（172/276），見表2。

表1　熒光定量PCR技術與結核菌快速培養檢測結果

表2　熒光定量PCR技術與結核涂片抗酸檢查結果

3　討論

肺結核病原學檢測是發現結核桿菌的重要途徑。傳統直接涂片抗酸染色顯微鏡檢查雖然在操作性、及時性及經濟性方面具有一定優勢，但是敏感性較低，通常標本需達到100000條菌/ml的濃度才得到陽性結果，特異性差［5-7］。而培養法作為結核病診斷的“金標準”，具有較高的敏感度和特異性，但該方法具有周期長的缺點，常常需要4～8周才能出結果，且在結核與非結核分枝桿菌的辨別上，需要采用進一步鑒定［8-9］。

熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，通過對熒光信號累積的監測，實現對PCR進程的監測，并能通過Ct值和標準缺陷對樣品中的DNA或cDNA進行測定，1 d即可發放檢驗結果。該方法，在密閉狀態下進行PCR擴增，有效保證了擴增物的無污染性，避免出現假陽性結果，檢測的靈敏度與特異性也較高［10-12］。

本研究中收集1000例肺結核患者痰液標本，經過三種方法檢測，結果顯示，熒光定量PCR技術診斷陽性率27.6%，結核菌快速培養陽性率25.2%，結核涂片抗酸檢查陽性率17.2%。結核抗酸菌涂片陽性率低于熒光定量PCR技術及快速培養法（P＜0.05）。熒光定量PCR技術與快速培養陽性符合率為91.3%，原因是結核患者用抗結核藥物治療后，結核菌受到抑制，無法培養出活的結核菌，但PCR技術可以檢測出結核菌的基因片段，說明結核菌PCR技術診斷肺結核的特異性及敏感性均較高。此外，本實驗室潔凈度達到BSL-3生物安全實驗室及環保相關要求，通過及早診斷、及早治療，有效控制結核病，為營造和諧、健康的環境起到積極作用。

綜上所述，利用熒光定量PCR技術檢測結核分枝桿菌DNA，診斷肺結核由傳統培養法的4～8周縮短至1 d即可發放檢驗結果，能使肺結核患者得到早期診斷及有效治療，縮短患者診斷時間，降低患者治療費用，對有效控制結核病起到積極的作用。

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【中圖分類號】R440

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9316（2016）11-0169-03

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2016.11.115

作者單位：昆明市傳染病醫院/昆明市第三人民醫院檢驗科，云南昆明650301

Application of Fluorescence Quantitative PCR Technique in the Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis

WANG Lin WANG Hui LI Caixin QU Chunyan MA Yuanxiao Department of Laboratory，Kunming Municipal Infectious Disease Hospital/ Kunming Third People's Hospital，Kunming Yunnan 650301，China

【Abstract】