白花蛇舌草中多糖抑制骨肉瘤的作用機制

張　韜，陳冬冬，翁　艷，馮爾宥，張怡元*

(1.廈門大學附屬福州第二醫院骨科研究所，2.廈門大學附屬福州第二醫院骨科，福建福州350007)

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白花蛇舌草中多糖抑制骨肉瘤的作用機制

張韜1，陳冬冬2，翁艷2，馮爾宥2，張怡元2*

(1.廈門大學附屬福州第二醫院骨科研究所，2.廈門大學附屬福州第二醫院骨科，福建福州350007)

摘要：為探討白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)活性成分對骨肉瘤的作用及其機制，對白花蛇舌草中分別提取的黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類化合物，用噻唑藍(MTT)法檢測不同提取物對MG-63細胞活性的影響；同時建立裸鼠骨肉瘤移植瘤模型，觀察不同提取物對移植瘤生長的抑制作用；并通過流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期變化，蛋白質免疫印記(Western blot)檢測Bax及Bcl-2蛋白表達水平.結果顯示：4種提取物都對MG-63細胞的增殖具有明顯抑制作用，并呈現明顯的劑量依賴性，最優藥物質量濃度為80 μg/mL；在此質量濃度下4種提取物對裸鼠移植骨肉瘤均具有抑制作用，其中多糖類對MG-63細胞活性和移植瘤生長的抑制作用最強，明顯促進MG-63細胞凋亡，阻滯細胞周期；Bax表達量在48 h內隨著白花蛇舌草多糖類提取物作用時間延長而增加，而Bcl-2表達量則降低.由上述結果可知，白花蛇舌草活性成分中多糖類的抗腫瘤活性最強，其作用機制可能是通過抑制骨肉瘤細胞增殖、促進細胞凋亡和阻滯細胞周期來達到抑瘤效果.

關鍵詞：白花蛇舌草；骨肉瘤；凋亡

骨肉瘤是青少年中最常見的原發惡性骨腫瘤，腫瘤惡性程度高，預后差，給家庭和社會帶來極大負擔.目前，手術是骨肉瘤最有效的治療方法，但肉瘤位置特殊、術后易轉移和手術費用高等均是影響患者治療的因素，因此尋找其他經濟、安全的保肢治療方案尤為重要.白花蛇舌草(Hedyotisdiffusa，HD)屬茜草科耳草屬植物，具有清熱解毒、消痛散結、利尿消腫、抗菌消炎、免疫調節及抗癌的功效，是用于治療肺癌、胃癌、腸癌、乳腺癌、宮頸癌、淋巴瘤等癌癥的中藥復方中常用的單味藥[1-2]，但其在治療骨肉瘤中的作用鮮有報道.研究發現，HD水提取物、乙酸乙酯萃取物、醇提取物都具有抗腫瘤作用，其有效成分有黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類等[3].本研究首先通過體外實驗篩選HD有效成分中抑制骨肉瘤細胞株MG-63增殖最明顯的成分，然后通過建立裸鼠移植瘤模型，觀察HD有效成分對移植瘤生長以及骨肉瘤MG-63細胞增殖、凋亡和細胞周期的影響，并初步探討其作用機制.

1材料與方法

1.1材料

人骨肉瘤MG-63細胞株(南京科佰生物科技有限公司)，BALB/C裸鼠(體質量(18±2) g，吳氏實驗動物中心)，HD黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類提取物(福州大學中藥研究所饋贈)，胎牛血清(FBS,Hyclone，美國)，DMEM培養基(Hyclone，美國)，噻唑藍(MTT，Sigma，美國)，RIPA裂解液、BCA法蛋白定量試劑盒和UltraECL 底物化學發光檢測試劑盒(Invitrogen，美國)，鼠抗人Bcl-2、Bax及內參GAPDH一抗，羊抗鼠辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(Abcam，英國)；Annexin-FITC-PI細胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技有限公司).

1.2細胞培養

將MG-63細胞接種于細胞培養瓶中，加入含10%(體積分數，不同)FBS的DMEM培養基，置于37 ℃、5%(體積分數)CO2的培養箱中培養，每48 h傳代1次，取對數生長期的細胞用于后續實驗.

1.3MTT法

細胞生長至對數期后胰酶消化，培養基重懸，96孔板中每孔加入200 μL細胞懸液(細胞數約5×103).加入20 μL HD提取物(黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類)，終質量濃度為10，20，40，80，160 μg/mL，生理鹽水作陰性對照，相同終質量濃度順鉑作陽性對照，每組重復6孔.培養約24 h，待細胞貼壁后棄培養基，每孔加入20 μL MTT(終質量濃度為5 mg/mL)，繼續培養4 h；棄上清，每孔加入160 μL 二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，待結晶紫完全溶解后用酶標儀測定492 nm下吸光值(A)，計算細胞生存率，生存率=(A實驗-A陰性對照)/(A陽性對照-A陰性對照)×100%.

1.4骨肉瘤裸鼠模型的建立

細胞培養至對數期后調整密度至5×107mL-1.充分麻醉裸鼠后，無菌操作臺上在裸鼠右后肢脛骨上端行10 mm縱切口，剪開皮膚，暴露脛骨上端；用1 mL注射器緩慢鉆入脛骨結節和脛骨內側髁之間的骨皮質，穿透后拔出.用微量注射器向脛骨髓腔中注入0.2 mL準備好的細胞懸液(細胞數約1×107)，邊注射邊回抽針頭，注射完后用5-0#縫線關閉切口.術后SPF級獨立送回風凈化籠中飼料并觀察成瘤情況.

1.5動物分組及給藥

荷瘤裸鼠隨機分為5組：黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類處理組[3]，采用隔日灌胃給藥，給藥劑量為50 mg/kg；對照組，隔日給予同等劑量生理鹽水灌胃.20 d后處死裸鼠，剝離移植瘤，稱質量，取平均值.

1.6流式細胞儀檢測細胞凋亡及周期

細胞培養至對數期后調整密度為1×106mL-1，接種于細胞培養瓶，5% FBS的DMEM培養基中繼續培養24 h；更換無血清的DMEM培養基同步化培養24 h；最后更換為5%FBS的DMEM培養基，并加入終質量濃度為80 μg/mL的多糖類提取物，分別培養24和48 h.收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后用預冷的70%(體積分數)乙醇固定，4 ℃過夜；離心去除固定液，PBS洗滌1次，收集的細胞加入預先配好的碘化丙啶(PI)溶液，室溫避光染色30 min，流式細胞儀檢測.

1.7蛋白質免疫印記(Western blot)

細胞加藥分別培養0，6，12，24，48 h后收集細胞并裂解，取樣品裂解液進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，用含5%(質量分數)脫脂奶粉的吐溫(TBST)溶液封閉1 h；洗膜后將封閉后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜與一抗4 ℃孵育過夜；洗膜后在室溫條件下與二抗(1∶5 000稀釋)孵育1 h；洗膜后加入底物化學發光試劑，顯影、洗片、晾干.用凝膠圖像分析儀掃描照片，并采用灰度分析軟件ImageJ 1.48u計算各蛋白條帶的灰度值.

1.8統計學分析

統計學軟件為SPSS 13.0，數據表示為平均值±標準差，兩樣本均數比較采用t-檢驗，p<0.05認為差異顯著.

2結果

2.1HD提取物對MG-63細胞活性的影響

如圖1所示，HD的4種主要提取物(黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類)都對MG-63細胞的增殖具有抑制作用，隨著藥物質量濃度增加，細胞生存率越低，呈現明顯的劑量依賴性，但當藥物終質量濃度升高至160 μg/mL時，細胞生存率與80 μg/mL時相比差異不顯著(p>0.05).其中，多糖類對MG-63細胞的生長抑制作用最明顯，半抑制質量濃度(IC50)為42.5 μg/mL，在藥物終質量濃度為20，40，80，160 μg/mL時，細胞生存率分別為64.5%，52.1%，34.7%和32.2%，都顯著低于黃酮類、三萜酸類和香豆素類(p<0.05)，但顯著高于陽性對照(p<0.05).

圖1　HD提取物對MG-63細胞活性的影響Fig.1The effects of HD extracts on activity of MG-63 cells

2.2HD提取物對移植瘤的影響

根據2.1小節實驗結果，選擇最優藥物終質量濃度80 μg/mL作為裸鼠給藥劑量.裸鼠移植瘤模型實驗結果顯示，所有裸鼠都成活，各藥物處理組移植瘤質量(香豆素類(0.88±0.11) g、黃酮類(0.39±0.12) g、三萜酸類(0.75±0.13) g和多糖類(0.22±0.07) g)都顯著小于陰性對照組(1.72±0.47) g(p<0.05)，且多糖類處理骨肉瘤后的移植瘤質量最小，顯著小于三萜酸類、黃酮類和香豆素類處理組(p<0.05)(圖2).

圖3　HD多糖類提取物對MG-63細胞凋亡及周期的影響Fig.3The effect of HD polysaccharides on apoptosis and cell cycle of MG-63 cells

(a)HD處理后的骨肉瘤移植瘤照片(重復3次)； (b)HD處理后的骨肉瘤移植瘤質量. *表示與陰性對照比較差異顯著(p<0.05)； #表示與多糖類比較差異顯著(p<0.05).圖2　HD提取物對骨肉瘤瘤質量抑制率的影響Fig.2The effects of HD extracts on weight inhibition rate of osteosarcoma

2.3HD多糖類提取物對MG-63細胞凋亡和細胞周期的影響

采用流式細胞儀檢測HD活性成分中抑瘤效果最強的多糖類提取物對MG-63細胞凋亡和細胞周期的影響，實驗結果如圖3所示.藥物處理24和48 h后細胞凋亡率分別為18.48%和26.96%，顯著高于陰性對照組(0 h)的0.02%(p<0.05)，提示HD多糖類提取物明顯促進了MG-63細胞凋亡，且隨著處理時間延長，細胞凋亡率有所升高.另外，藥物處理24 h后G1期、S期和G2期MG-63細胞分別為42.16%，43.34%和12.44%；加藥48 h后G1期、S期和G2期MG-63細胞占分別為43.75%，42.58%和9.15%；陰性對照組G1期、S期和G2期MG-63細胞占分別為32.48%，58.39%和9.13%.該結果提示HD多糖類提取物具有阻滯細胞周期的作用，但隨著處理時間延長，細胞周期阻滯效果不明顯.

2.4HD多糖類提取物對Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

Western blot實驗結果顯示：促凋亡蛋白Bax表達量在48 h內隨著HD多糖類提取物作用時間延長而增加；相反，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達量在48 h內隨著HD多糖類提取物作用時間延長而降低(圖4).上述結果提示HD多糖類提取物具有誘導MG-63細胞凋亡的作用.

*表示與0 h相比差異顯著(p<0.05).圖4　HD多糖類提取物對MG-63細胞Bax和Bcl-2表達的影響Fig.4The effect of HD polysaccharides on expression of Bax and Bcl-2 in MG-63 cells

3討論

目前公認的骨肉瘤治療模式是“術前新輔助化療+腫瘤手術切除+術后輔助化療”；另外，介入治療、冷熱消融治療、中藥治療也是骨肉瘤的輔助治療手段；還有一些治療方法尚處于研究階段，如基因治療、免疫治療、干細胞治療和光動力治療等.其中，臨床報道證實中藥能夠為骨肉瘤治療提供有效的方法，黃金昶等[4]使用自制骨瘤消膠囊聯合中藥湯劑治療22 例骨肉瘤患者就取得了較好的治療效果.

HD抗腫瘤的活性成分有黃酮類(槲皮素、山奈酚)、三萜酸類(熊果酸、齊墩果酸)、香豆素類和多糖類等化學成分，目前臨床上主要用HD多成分注射液[5]，而對其單一活性成分的抗腫瘤研究甚少.有研究表明HD可降低化療藥物引起的乳腺癌細胞毒性[6]，大量研究也發現HD可誘導前列腺癌[7]、宮頸癌[8]、肝癌[9]、腎癌[10]、結腸癌[11]、膠質瘤[12]等細胞凋亡和抑制細胞增殖，還有研究發現HD也可誘導骨肉瘤細胞凋亡和抑制細胞增殖[13].

本研究發現，HD提取物中黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類都會抑制骨肉瘤MG-63細胞的增殖，最佳抑制質量濃度均為80 μg/mL，其中多糖類抑制效果最好，細胞生存率僅為34.7%.另外，移植瘤實驗結果顯示，香豆素類、黃酮類、三萜酸類和多糖類處理的裸鼠移植瘤質量都明顯小于陰性對照組(p<0.05)，且多糖類處理后的移植瘤質量最小，明顯小于三萜酸類、黃酮類和香豆素類(p<0.05).黃酮類、三萜酸類、香豆素對MG-63細胞的抑制作用幾乎相當，但三者對裸鼠移植瘤的抑制作用卻有較大差異，可能由于三者在裸鼠體內吸收和代謝存在差異.

進一步對抑瘤作用最強的多糖類提取物進行了研究，結果顯示：HD多糖類提取物明顯促進了MG-63細胞凋亡，且隨著藥物處理時間延長細胞凋亡率有所升高;同時也具有阻滯細胞周期的作用，但隨著藥物處理時間延長，細胞周期阻滯效果變得不明顯，可能藥物作用時間并不是影響細胞周期的主要因素.通過分析HD多糖類提取物對Bax和Bcl-2蛋白表達的影響，發現促凋亡蛋白Bax表達量在48 h內隨著HD多糖類提取物作用時間延長而增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達量則降低，說明HD多糖類提取物一方面激活Bax的表達，一方面抑制Bcl-2的表達，共同起到促進細胞凋亡的作用.

綜上所述，HD提取物中黃酮類、三萜酸類、香豆素類和多糖類都具有抗腫瘤活性，其中多糖類的抗腫瘤活性最強，其作用機制可能是通過抑制骨肉瘤細胞增殖、激活Bax表達并抑制Bcl-2表達共同促進細胞凋亡，以及阻滯細胞周期等途徑發揮作用，最終達到抑制骨肉瘤的效果.

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doi：10.6043/j.issn.0438-0479.201510010

收稿日期：2015-10-16錄用日期：2016-01-18

基金項目：福建省自然科學基金(2015J01358)

*通信作者：zhangyiyuan_fj@126.com

中圖分類號:R 965.1

文獻標志碼：A

文章編號：0438-0479(2016)04-0501-05

Effect of Hedyotis diffusa Polysaccharides on Osteosarcoma

ZHANG Tao1，CHEN Dongdong2，WENG Yan2，FENG Eryou2，ZHANG Yiyuan2*

(1.Department of Orthopedics Institute，Fuzhou Second Hospital，2.Department of Orthopedics，Fuzhou Second Hospital，Fuzhou 350007，China)

Abstract:To investigate the effect of Hedyotis diffusa (HD) on osteosarcoma，the MTT assay was used to detect the effects of flavonoids，triterpene acids，coumarin and polysaccharides extracted from HD on MG-63 cell activity.Osteosarcoma xenograft model in nude mice was established to evaluate the effects of HD extracts on growth of osteosarcoma.Apoptosis and cell cycle of MG-63 cells were detected by flow cytometry，and Western blot was performed to assay the expression of Bax and Bcl-2.Results showed that these four types of HD extracts significantly inhibited the proliferation of MG-63 cells with the optimal drug concentration at 80 μg/mL，which exhibited a significant dose-dependent manner.The HD extracts also inhibited the growth of osteosarcoma under the optimal drug concentration.Wherein the HD extracts，polysaccharides showed the strongest inhibition effect both on the proliferation of MG-63 cell and the growth of osteosarcoma.Data showed that polysaccharides significantly promoted the cell apoptosis，arrested the cell cycle of MG-63 cells，up-regulated the expression level of Bax and down-regulated the expression level of Bcl-2 in 48 h treatment.Therefore，among the HD extracts，polysaccharides may have the strongest inhibition effect on osteosarcoma via the inhibition of cell proliferation，the promotion of cell apoptosis，and the arresting of MG-63 cell cycles.

Key words:Hedyotis diffusa;osteosarcoma;apoptosis

引文格式：張韜，陳冬冬，翁艷，等.白花蛇舌草中多糖抑制骨肉瘤的作用機制[J].廈門大學學報(自然科學版)，2016,55(4)：501-505.

Citation：ZHANG T，CHEN D D，WENG Y,et al．Effect ofHedyotisdiffusapolysaccharides on osteosarcoma[J].Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(4)：501-505．(in Chinese)