昆蟲內生真菌Chaetomium globosum ZWC5的分離鑒定及其抗癌活性代謝產物的研究

楊會祥，鄧園園，李　薇，呂靜南，徐　嬋，馬云瑞，楊新洲，林親雄

(中南民族大學藥學院，中國 武漢　430074)

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昆蟲內生真菌Chaetomium globosum ZWC5的分離鑒定及其抗癌活性代謝產物的研究

楊會祥，鄧園園，李薇，呂靜南，徐嬋，馬云瑞，楊新洲，林親雄

(中南民族大學藥學院，中國 武漢430074)

摘要為了研究中華稻蝗內生真菌ZWC5菌株及其活性代謝產物, 通過菌株形態和其rDNA的ITS序列分析，鑒定其為球毛殼霉(Chaetomium globosum)；采用MTT法和流式細胞技術測定其代謝產物的抗癌活性，結果表明其石油醚提取物對肝癌細胞HepG2和SMMC-7721的IC50分別為22.1 mg/L,33.8 mg/L，可誘導HepG2細胞凋亡，而對正常肝細胞LO-2未顯示明顯的細胞毒性；GC-MS檢測分析顯示其醚提物主要含12種化學成分.

關鍵詞中華稻蝗; 內生真菌; 球毛殼霉; 抗癌活性; 氣相色譜-質譜

內生菌是一類長期與寄主共同生存的特殊環境微生物，它們與寄主保持多樣的共生關系，在寄主的生存周期中起著一定的生理作用[1].內生菌廣泛分布于昆蟲體內，幾乎所有的昆蟲都有內生菌[2].昆蟲種類豐富、結構復雜、生活環境特殊，所以源于昆蟲體內的內生菌也同樣具有生物多樣性、復雜性和特殊性，其內生菌可能會產生結構新穎、類型豐富的活性次級代謝產物，而且其內生菌產生的活性化合物的結構類型已遠超出昆蟲本身代謝產物的范圍.因此，昆蟲內生菌是重要的活性次生代謝產物的源泉.國內外的研究者已從昆蟲內生菌中分離出生物堿類、萜類、甾體、醌類、肽類、內酯、酚類等化合物，這些化合物具有抗菌、細胞毒性、抗瘧活性、促進神經膠質細胞生長、抗動脈粥樣硬化、免疫抑制、致突變等多種生理或藥理活性[3]，其中一些化合物結構新穎并具抗癌活性，如從昆蟲內生菌蟲草棒束孢(Isariafarinosa)分離的farinosone B及paecilosetin對小鼠白血病細胞P388的IC50分別為1.1 mg/L和3.2 mg/L[4]，從昆蟲內生菌Cordycepssinensis中分離的甾體化合物1對腫瘤細胞有較強的抑制活性[5].從同翅目介殼蟲總科的昆蟲內生菌Paecilomycescinnamomeus中分離得到一個新的環肽paecilodepsipeptide A對KB和BC細胞的IC50分別為5.9 mg/L和5.6 mg/L[6].郭志勇等從菜粉蝶分離到交鏈孢霉屬真菌，從其乙酸乙酯萃取物中分離的4-甲氧基格鏈孢酚，二氫騰毒素，騰毒素，環羥基脯亮二肽，5′-methoxy-6-methyl-biphenyl-3,4,3′-triol和altenusin共6種化合物從對EGFR和VEGFR-1及c-Met三種受體酪氨酸激酶具有不同程度的抑制活性[7].但與昆蟲種類研究相比,目前對昆蟲共生菌及其代謝產物研究偏少，進行昆蟲內生菌活性代謝產物，特別是抗癌活性化合物的篩選是一個前景廣闊的研究領域.

本研究小組在研究共生菌的活性次生代謝產物的過程中，從中華稻蝗蟲體內分離到一株內生真菌，經鑒定為球毛殼霉(Chaetomiumglobosum). MTT方法檢測發現其發酵液石油醚提取物對HepG2和SMMC-7721兩個肝癌細胞株具有顯著的細胞毒性，且可以引起HepG2細胞的凋亡，而對正常肝細胞LO-2未顯示出明顯的毒性，具有深入研究的意義，本文總結與報道現階段取得的研究成果.

1材料和方法

1.1儀器與材料

活性測試用顯微鏡：B202型(Olympus)；酶標儀：Spectra Max 340PC型(Molecular Devices)；旋轉蒸發器：RV10型(IKA公司)；流式細胞儀：FACSCALIBUR型(BD公司)；GC-MS儀：DSQ Ⅱ(Thermo公司)；毛細管柱：Zebron ZB-35HT (Phenomenex公司)；PCR儀：C1000 touch(Bio-Rad公司)；凝膠成像系統：ChemiDoc XRS型(Bio-Rad公司)；細胞株：肝癌細胞株HepG2和Hep3B及人胚腎成纖維細胞株HEK-293(American Type Culture Collection，Rockville, MD, USA)；RPMI1640培養基(Gibco Inc，美國)；胎牛血清(四季青公司，杭州)；吖啶橙、溴化乙啶(Sigma，美國).

1.2昆蟲材料收集與共生真菌的分離純化

蝗蟲于2013年8月捕捉于武漢市馬鞍山森林公園，經湖北省林業科學研究院陳京元研究員鑒定為中華稻蝗(Oxyachinensis).將昆蟲在75%酒精中浸泡5 min，再用0.5%的次氯酸浸泡2 min，表面滅菌后用無菌水沖洗蟲體3次，用無菌濾紙吸干水分，在無菌條件下用解剖刀將蟲體切成0.5 cm長的小塊移接到PDA培養基(含氨芐青霉素和鏈霉素各100 mg/L)上，28 ℃培養7～14 d，將蟲體組織塊中長出的菌絲用PDA培養基連續重復純化3次.同時將未進行表面消毒不做剪切的蟲體置于PDA平板上作為對照，以此作為分離得到的真菌是否為昆蟲內生真菌的主要參考依據，分離菌株采用甘油低溫凍存，菌種保存于中南民族大學藥學院微生物菌種庫.

1.3真菌ZWC5的鑒定

菌落形態觀察：將ZWC5菌株接種在PDA平板上培養14 d，連續觀察菌絲粗細、顏色、菌落形態、培養基背面色素等形態學特征.

核糖體ITS序列的測定：取ZWC5適量菌絲接于PDA液體培養基中，25 ℃震蕩(150 r/min)培養5 d，過濾得菌絲體，用無菌水沖洗3次，冷凍干燥后備用.ZWC5菌株總DNA的提取方法參照文獻[8]進行，提取總DNA經瓊脂糖電泳檢測合格后進行目的片段的PCR擴增與測序.ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′由武漢擎科生物有限公司合成.PCR反應體系總體積50 μL，包括：2.5 mmol/L的dNTP 2 μL，5 U/μL的Taq酶0.4 μL，25 mmol/L的MgCl23μL，5 μL的10×PCR Buffer(試劑由大連寶生物工程有限公司提供)，25 μmol/L的ITS1和ITS4各1 μL，10 ng的DNA模板，補足去離子水使總體積達到50 μL，進行PCR擴增.PCR擴增產物由上海桑尼生物科技有限公司進行純化和測序.

1.4ZWC5發酵液石油醚提取物的制備

將ZWC5菌株活化后，用PDA液體培養基，28 ℃下180 r/min避光振蕩培養4 d，減壓濃縮3倍，按1∶1的體積比加入丙酮，超聲1 h，破壁，真空減壓濃縮除去丙酮，菌體和菌液的混合溶液按體積比1∶1采用石油醚萃取3次，40 ℃真空減壓濃縮干燥，即為石油醚提取物(ZWC5-Pe).

1.5ZWC5-Pe的抗肝癌活性測定[9]

將ZWC5-Pe固體5 mg溶于25 μL的DMSO中，配成200 g/L的母液.取對數生長期的HepG2，SMMC-7721和LO-2細胞，調節細胞濃度為5×104個/mL，每孔0.2 mL接種至96孔培養板，培養24 h后每孔分別添加待測樣品和1640細胞培養液各0.2 mL，母液用無小牛血清的1640培養液配制成終濃度為10，20，40，100，200 mg/L的樣品液，每個濃度設3復孔，同時設不加樣品的陰性對照、不加樣品和細胞的空白對照，繼續培養48 h后，分別加入5 g/L的MTT 20 μL繼續培養4 h后，吸去培養液，每孔加入0.15 mL DMS，振搖30 min，于550 nm下測定每孔A值，計算各樣品對肝癌細胞的生長抑制率和半數抑制濃度(IC50).

1.6ZWC5-Pe誘導肝癌細胞的凋亡

肝癌細胞凋亡形態的觀察：調節對數生長期的HepG2和SMMC-7721細胞濃度為5×104個/mL，接種于6孔培養板中，24 h細胞貼壁后，加入不同濃度的樣品液，培養48 h，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態并拍照[10].

采用流式細胞儀Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡[11]：將處于對數生長期的HepG2細胞吹打分散于含10%胎牛血清的培養基中，制備單細胞懸液，每孔4×105接種于6孔板中.37 ℃下5%CO2培養箱中培養24 h，加入一定濃度的樣品液干預細胞24 h；同時設置陰性對照組，作用終止時收集細胞于離心管，用遇冷PBS洗滌細胞2次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，將細胞懸液懸浮于500 μL 1×Buffer中，每管加Annexin V-FITC 5 μL和 PI 5 μL，震蕩混勻，室溫下避光染色10 min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡及凋亡率.

1.7ZWC5-Pe化學成分的GC-MS分析

氣相色譜條件：采用ZB-35HT毛細管柱(0.25 mm×30 m)和ECD檢測器，以高純氦氣為載氣，設定起始柱溫度50 ℃，以3 ℃/min的速度升溫至210 ℃，溫度穩定后以1 mL/min的流速常規進樣.質譜條件：以離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，轉接口溫度280 ℃，電子倍增器電壓350 V，質量掃描范圍35～400 amu進行電子轟擊離子源質譜法測定各成分的分子離子峰.在NIST98.L標準譜庫內檢索GC-MS獲得的質譜數據，結合相關文獻資料確定化學成分，采用峰面積歸一法定量各成分的相對含量.

2結果和分析

2.1ZWC5菌種鑒定

菌落形態(圖1，彩圖見封三)：在PDA培養基上菌絲最初為白色，后期淡褐色，具灰白色氣生菌絲，氣生菌絲稀少，背面棕褐色，常具橄褐色滲出物，菌落邊緣常呈不整齊的波裂狀，與文獻[8]的描述基本一致.

ZWC5菌株ITS序列的GeneBank 登錄號為KT832070.在GenBank數據庫中進行BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) 分析，在GenBank數據庫中獲得ITS rDNA 序列與ZWC5菌株相近的菌株，計算ZWC5菌株與相近菌株的ITS序列的核苷酸差異值，以此進行最大同源性排序，采用Neighbor-joining法構建相近菌株的系統發生樹.經ITS rDNA序列比對分析，ZWC5的ITS rDNA 序列與ChaetomiumglobosumHM365254，KM030576，HQ914911菌株的序列同源性均為100%(圖2).根據菌落形態與5.8S ITS rDNA序列分析的結果，將ZWC5菌株鑒定為球毛殼霉(Chaetomiumglobosum).

圖1　ZWC5菌株在PDA平板上的菌落形態Fig.1　Colony morphology of fungus ZWC5 on the PDA culture medium

圖2　ZWC5菌株基于rDNA ITS序列的系統進化樹Fig.2　Phylogenetic tree of fungus ZWC5 based on rDNA ITS sequence

圖3　ZWC5-Pe對細胞的體外增殖抑制活性Fig.3　Cell proliferation inhibitory activity of ZWC5-Pe in vitro

2.2ZWC5-Pe的體外抗肝癌活性

采用MTT法，評價了ZWC5-Pe對HepG2和SMMC-7721的體外抗腫瘤活性，結果顯示ZWC5-Pe在5～200 mg/L的范圍內，對兩種腫瘤細胞均顯示抗腫瘤活性，且有明顯的量效關系，對HepG2和SMMC-7721細胞的IC50分別為22.1 mg/L和33.8 mg/L，而200 mg/L的ZWC5-Pe對LO-2細胞幾乎不顯示毒性(圖3).

2.3ZWC5-Pe對肝癌細胞形態的影響

人肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721經ZWC5-Pe提取物處理后，用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，結果(圖4，彩圖見封三)表明，隨樣品濃度增加，人肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721逐漸變圓，脫落，懸浮細胞逐漸增多，且懸浮細胞出現皺縮，周圍出現凋亡小體狀，呈現明顯的凋亡特征，而陰性對照組細胞生長良好，細胞貼壁較牢，細胞間緊密相聯.

圖4　ZWC5-Pe對HepG2及SMMC-7721細胞形態的影響Fig.4　Effects of ZWC5-Pe on cell morphology of HepG2 and SMMC-7721

2.4ZWC5-Pe誘導肝癌細胞凋亡

ZWC5-Pe誘導HepG2肝癌細胞凋亡檢測結果(圖5)顯示，隨著ZWC5-Pe給藥濃度增加，HepG2細胞凋亡比例隨給藥濃度梯度遞增. 50，100，150 mg/L ZWC5-Pe作用HepG2細胞24 h后，早期凋亡比例分別為30.0%,31.9%,2.0%.晚期凋亡細胞，也即壞死細胞，能夠被FITC染色，也能被PI染色，細胞分布在散點圖上象限.該結果表明ZWC5-Pe能夠顯著地引起HepG2細胞的凋亡.

2.5ZWC5-Pe化學成分的GC-MS分析

ZWC5-Pe采用1.7的實驗流程，利用GC-MS方法檢測ZWC5-Pe的化學成分，其GC-MS總離子流圖譜(圖6)如下.分析結果表明，真菌ZWC5的石油醚提取物(ZWC5-Pe)含有多種成分，主要化學成分有12種.根據各分子離子碎片峰的相似度在NIST98.L 標準譜庫中檢索，可初步鑒定ZWC5-Pe提物中含有的12種主要化學成分(表1)，大多為烷烴、脂肪酸，其中含量超過10%的成分初步鑒定為2,5-二叔丁基酚,硬脂酸,異黃酮苷,酞酸二丁酯，還有許多含量較低的分子離子峰未能在庫中檢出.

圖6　ZWC5-Pe提取物的GC-MS譜圖Fig.6　GC-MS spectrum of ZWC5-Pe extracts

序號保留時間/min峰面積/%化合物名稱分子式19.3021.82,6,10-trimethyl-dodecaneC15H32211.0511.53-methyl-tetradecaneC15H32312.0222.1Diethyl-2-(2-yanoethyl)-malonnateC10H15NO4412.93013.62,5-bis(1,1-dimethylethyl)-phenolC14H22O514.4280.82-methyl-pentadecaneC16H34614.5330.6HexadecaneC16H34717.8180.5TetradecanoicacidC14H28O2818.5650.3Tri(2-chloroethyl)-phosphataeC6H12Cl3O4P920.5036.81,2-BenzenedicarboxylicacidC16H22O41022.16024.8OctadecanoicacidC18H36O21123.13911.2DaidzinC21H20O31226.29716.7DibutylphthalateC16H22O4

3討論

球毛殼霉菌(Chaetomiumglobosum)是一種常見的腐霉菌，廣泛分布于自然界的各種基物和發霉的含纖維素的日常用品上，包括植物殘體、土壤、草食和雜食動物及鳥類和鼠類的糞便、種子、材、皮革等[12].有研究報道從側柏葉、銀杏葉中分離到球毛殼菌[13-14]，本研究從中華稻蝗體內分離出該菌尚屬首次報道，球毛殼菌能否與蝗蟲形成共生關系尚未明確，也可能為球毛殼菌的孢子存在于蝗蟲的消化道內，進而被分離出來.

球毛殼菌的代謝產物主要包括麥角邕醇、大黃酚、棒曲霉素、球毛殼菌素類物質等[15]，其中球毛殼菌素A對腐霉菌、灰霉病菌、立枯絲核菌、鐮刀菌等植物病原真菌具有良好的廣譜殺菌活性，同時臨床證明其具有抗腫瘤活性[13].本研究發現其發酵液的醚提物對肝癌細胞株HepG2和SMMC-7721有顯著抗肝癌活性，且對正常細胞沒有明顯的細胞毒性，因此，該菌的代謝產物具有很好的研究價值與潛力.由于GC-MS未檢測到球毛殼菌素A，課題組將對其抗癌活性成分進行深入的研究.

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(編輯WJ)

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2016.04.003

收稿日期：2015-08-01

基金項目：中南民族大學十二五“民族藥學”國家級實驗教學示范中心項目;國家級大學生創新訓練項目(GXX14211)

*通訊作者,E-mail：linqinxiong@mail.scuec.edu.cn

中圖分類號Q819

文獻標識碼A

文章編號1000-2537(2016)04-0017-06

Study on Isolation and Taxonomy Determination of Insect Derived Endophytic FungusChaetomiumGlobosumZWC5 and Its Anticancer Active Metabolites

YANGHui-xiang,DENGYuan-yuan,LIWei,LYUJing-nan,XUChan,MAYun-rui,YANGXin-zhou,LINQin-xiong*

(College of Pharmaceutical Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

AbstractIn order to study the endophytic fungus ZWC5 from Oxya chinensis and its active metabolites，the fungus ZWC5 is determined as Chaetomium globosum based on fungus’s morphology and its rDNA ITS sequence analyses. The anticancer activity of its metabolites was tested by the MTT method and flow cytometry. Our results indicate that the petroleum ether extract of Chaetomium globosum ZWC5 can induce apoptosis of HepG2 cell with IC50values of 22.1 mg/L and 33.8 mg/L against hepatocellular carcinoma HepG2 and SMMC-7721 cells, respectively. It did not show any obvious toxicity against normal liver LO-2 cell. Chemical analysis of its petroleum ether extract by GC-MS displays that the extract contained 12 main chemical constituents.

Key wordsOxya chinensis; endophytic fungi; Chaetomium globosum; anticancer activty; gas chromatography-mass spectrometry