健脾補土法組方含藥血清對體外嗅鞘細胞低氧/復氧損傷模型P65、P50及磷酸化IκBα表達的影響

李路迢，劉旺華*，李　花，彭智遠，周翠玲，付小金

（湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208）

·方藥研究·

健脾補土法組方含藥血清對體外嗅鞘細胞低氧/復氧損傷模型P65、P50及磷酸化IκBα表達的影響

李路迢，劉旺華*，李花，彭智遠，周翠玲，付小金

（湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208）

目的 探討健脾補土法組方含藥血清對體外嗅鞘細胞低氧/復氧損傷模型核因子KB（nuclear factor-kappa B，NFKB）的亞單位P65、P50及NF-KB抑制蛋白（P-IκBα）表達的影響。方法 將原代培養(yǎng)的嗅鞘細胞分為5組：正常血清對照組、正常血清+低氧組、低氧+依達拉奉含藥血清組、低氧+健脾補土法組方含藥血清組、正常血清+低氧+NF-KB抑制劑/抗氧化劑（PDTC，50 μmol/L）組，采用微需氧袋低氧/復氧的方法誘導嗅鞘細胞形成腦缺血再灌注損傷樣模型，用Western blot法檢測嗅鞘細胞胞漿P65、P50、P-IκBα和胞核P65、P50的含量。結果與正常血清對照組比較，正常血清+低氧組胞漿和胞核P65、P50，胞漿P-IκBα表達均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與正常血清+低氧組比較，低氧+依達拉奉組、低氧+健脾補土組、正常血清+低氧+PDTC組、低氧+健脾補土+PDTC組胞漿和胞核P65、P50，胞漿P-IκBα表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 健脾補土法組方能通過抑制嗅鞘細胞缺氧/復氧損傷后P65、P50、P-IκBα的過度表達，對NF-κB通路的活化具有抑制作用。

健脾補土法；嗅鞘細胞；低氧/復氧損傷模型；P65；P50；P-IκBα

〔Abstract〕Objective To investigate the effect of spleen-strengthening therapy contained serum on subgene P65，P50 of nudear factor-kappa B（NT-KB）and P-IκBα expression in olfactory ensheathing cells with hypoxia/reoxygenation injury. MethodsPrimaryculturedolfactoryensheathingcellswererandomlydividedintofivegroups：normalserum control group，normal serum+hypoxia group，hypoxia+edaravone contained serum group，hypoxia+spleen-strengthening therapy contained serum group，normal serum+hypoxia+NF-KB inhibitor/antioxidant（PDTC 50 μmol/L）group.The cerebral ischemiareperfusion injury model of olfactory ensheathing cells were induced by hypoxia/reoxygenation of micro-aerobic bags method. Then，the cytoplasm P65，P50，P-IκBα and nuclear P65，P50 content in olfactory ensheathing cells were detected by Western blot assay.Results Compared with normal serum control group，the cytoplasm and nucleus P65，P50，cytoplasm P-IκBα expression in normal serum+hypoxia group were significantly increased，the difference was statistically significant（P＜0.01）. Compared with normal serum control group，the cytoplasm and nucleus P65，P50，cytoplasm P-IκBα expression were lower in hypoxia+edaravone group，hypoxia+Jianpi Butu group，normal serum+hypoxia+PDTC group，hypoxia+Jianpi Butu+PDTC group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Spleen-strengthening therapy can prevent the activation of NF-κB signal path，which may be due to its inhihitory effect on P65/P50 and P-IκBα overexpression in olfactory ensheathing cells with hypoxia/reoxygenation injury.

〔Keywords〕spleen-strengthening therapy；olfactory ensheathing cells；hypoxia/reoxygenation injury model；P65；P50；P-IκBα

嗅球是哺乳類動物一生中能夠支持神經(jīng)再生的唯一中樞神經(jīng)組織［1］。一旦出現(xiàn)神經(jīng)細胞死亡，嗅上皮內不斷增殖的干細胞會產(chǎn)生新的神經(jīng)細胞。研究表明，嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cells，OECs）能使實驗室去髓鞘損傷的大鼠脊髓再形成髓鞘［2］，支持被切斷的軸突再生［3］，OECs促進神經(jīng)再生的作用成為神經(jīng)保護的重要切入點。前期動物實驗研究表明健脾補土法能抑制腦組織核因子κB（nuilear factor-κB，NF-κB）的表達，促進NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκBα）的表達，從而改善腦缺血再灌注損傷 （cerebral ischemia reperfusion injure，CIRI）大鼠神經(jīng)功能缺損，對CIRI起保護作用［4］。健脾補土法是否通過NF-κB通路保護OECs尚不清楚。本研究擬從NF-κB通路探討健脾補土法組方含藥血清對體外OECs低氧/復氧損傷模型的影響，進一步揭示健脾補土法組方對CIRI神經(jīng)細胞保護作用及其機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物SPF級雄性SD大鼠，220-250 g，用于含藥血清的制備（湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供）；SPF級新生＜1 d的SD大鼠，用于OECs的原代培養(yǎng)，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK（湘）2014-0011。

1.1.2藥物和試劑健脾補土法組方由人參15 g，黃芪15 g，白術12 g，山藥12 g，薏苡仁12 g，茯苓10 g，炙甘草6 g組成，從湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院購進。飲片浸泡30 min，首煎加6倍水，沸后文火煎1 h；第二煎加3倍水，水沸后文火煎30 min，兩次藥汁混合。濾過，于水浴鍋內蒸發(fā)濃縮為含生藥1 g/mL，滅菌分裝，4℃冰箱冷藏。依達拉奉注射液，15 mg∶10 mL購自國藥集團有限公司，批號H20080056。

DMEM-12培養(yǎng)液（Gibco公司，批號NAH1445、NAA1328）；胎牛血清（四季清公司，批號NAG1425、N281079）；2.5 g/L胰酶消化液 （批號J130049）、多聚左旋賴氨酸（PLL）（批號SH30396）、神經(jīng)生長因子（NGF）（批號5166141）、青霉素及鏈霉素溶液（批號J140055）（Sigma公司）；阿糖胞苷（A-arc）（Fluka公司，批號SLBB7404V）；PDTC（NF-κB抑制劑）（碧云天生物技術公司，批號S1809）；4%多聚甲醛（長沙市維爾生物技術有限公司，批號WB00018A）；免疫印跡試劑盒 （長沙市維爾生物技術有限公司，批號WB00036A）。

1.1.3主要儀器JY3002型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；DD-5型低速離心機 （長沙湘儀離心機儀器有限公司）；XDY-1型熒光倒置生物顯微鏡、SZM45-B2型連續(xù)變倍體視顯微鏡（寧波舜宇光學科技有限公司）；DD6M低速離心機 （德國赫提馳Hettich公司）；NU-437-400S型生物安全柜 （美國 Nuaire公司）；2406-2型 CO2培養(yǎng)箱（美國Shal Lab公司）；101-AB型電熱鼓風干燥箱 （天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1含藥血清的制備30只SD大鼠隨機分為正常血清組（Ⅰ組）、健脾補土法組方含藥血清組（Ⅱ組）、依達拉奉含藥血清組（Ⅲ組），每組10只。Ⅰ組等體積的蒸餾水灌胃；Ⅱ組灌胃健脾補土法組方藥液14.8 g/kg，相當于臨床等效劑量2倍；Ⅲ組腹腔注射依達拉奉注射液3.2 mg/kg，相當于臨床等效劑量。連續(xù)7 d，于末次給藥后30 min經(jīng)腹主動脈采血分離血清，56℃水浴滅活后過濾分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2嗅鞘細胞的分離、純化和鑒定參照文獻［5-6］，取出生＜1 d的新生SD大鼠，浸入75%的乙醇中2 min消毒，斷髓處死，無菌條件下取出嗅球，將嗅球剝除干凈后用眼科剪剪碎。加入2.5 g/L胰蛋白酶，消化15 min后，1 000 r/min離心10 min，棄上清，重復離心1次。加入培養(yǎng)液，用巴氏吸管輕輕吹打成細胞懸液，過篩網(wǎng)計數(shù)后以4.0×108/L的密度接種于未包被的培養(yǎng)瓶內。用差速貼壁+阿糖胞苷的方法對嗅鞘細胞進行純化；純化后換上條件培養(yǎng)液（1%胎牛血清+20 μg/L NGF+1%雙抗+DMEM-R），之后2-3 d半量換液1次。在第11天按常規(guī)法行NGFRp75免疫細胞化學染色鑒定細胞。

1.2.3含藥血清的合理化濃度摸索參照文獻［7］，取新鮮傳代的嗅鞘細胞，調細胞濃度5×107/L，接種于96孔板中用含10%胎牛血清血清培養(yǎng)24 h后，用無血清DMEM培養(yǎng)24 h，使細胞同步于G0/G1期。然后將細胞分成實驗組，各實驗組加入正常對照血清或含藥血清（0/1%/5%/10%/15%/20%），以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)24 h后以MTT法測定A570 nm吸光度，求出不同含藥血清濃度對應的細胞增殖抑制率，摸索出含藥血清的無毒性濃度。以對細胞生長無抑制作用（＜20%）的濃度作為無細胞毒的濃度，最后以最大無毒性濃度（15%）作為細胞學實驗工作濃度。

1.2.4細胞分組及缺氧復氧損傷模型的建立將OECs細胞隨機分為5組：正常血清對照組（A組）；正常血清+低氧（10%O2）組（B組）；低氧+依達拉奉含藥血清組 （C組）；低氧+健脾補土法組方含藥血清組（D組）；正常血清+低氧+PDTC（50 μmol/L）組（E組）。將培養(yǎng)板放入置于CO2培養(yǎng)箱內的厭氧盒內，加入微需氧產(chǎn)氣袋［8］和氧氣指示劑，誘導48 h后，恢復正常條件培養(yǎng)4 h。

1.2.5臺盼藍染色法檢測各組細胞活力胰酶消化貼壁細胞，制備單細胞懸液，并作適當稀釋；取少量細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9∶1混合，輕輕吹打混勻，染色2～3 min；顯微鏡下觀察，死細胞著淺藍色并膨大，無光澤；活細胞保持正常形態(tài)，無色透明有光澤。

1.2.6用Western blot法（免疫印跡法）檢測各組嗅鞘細胞胞漿內P65、P50、磷酸化IκBα（P-IκBα）的含量和胞核內P65、P50的含量提取胞漿蛋白及胞核蛋白，行SDS-PAGE電泳，轉膜2 h，用5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗為兔抗鼠P65（1∶200）、P50（1∶200）、P-IκBα（1∶200）及PCNA（1∶4 000）蛋白單克隆抗體，4℃孵育過夜；二抗為辣根過氧化物標記的山羊抗兔抗體（1∶3 000），室溫孵育1 h，加DAB顯色后用Quantity One專業(yè)灰度分析軟件分析自身灰度值，以目的基因條帶灰度與管家基因β-actin條帶灰度的比值表示蛋白的表達水平。

1.3統(tǒng)計學方法

2結果

2.1造模后各組細胞存活率

與正常血清對照組比較，正常血清+低氧組活細胞存活率降低，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與正常血清+低氧組比較，低氧+依達拉奉組、低氧+健脾補土組、正常血清+低氧+PDTC組細胞存活率升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1造模后各組OECs細胞存活率　　（±s，n=3）

表1造模后各組OECs細胞存活率　　（±s，n=3）

注：與正常血清對照組比較，##P＜0.01；與正常血清+低氧組比較，*P＜0.05。

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2.2各組OECs缺氧/復氧損傷模型胞漿P-IκBα、P65、P50表達的比較

與正常血清對照組比較，正常血清+低氧組胞漿P-IκBα、P65、P50表達均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與正常血清+低氧組比較，低氧+依達拉奉組、低氧+健脾補土組、正常血清+低氧+PDTC組胞漿P-IκBα、P65、P50表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2，圖1。

表2　48 h各組OECs胞漿P-IκBα、P65、P50表達 （±s，n=3）

表2　48 h各組OECs胞漿P-IκBα、P65、P50表達 （±s，n=3）

注：與正常血清對照組比較，##P＜0.01；與正常血清+低氧組比較，*P＜0.05。

組別正常血清對照組正常血清+低氧組低氧+依達拉奉組低氧+健脾補土組正常血清+低氧+PDTC組F值P值胞漿P-IκBα 0.09±0.02 0.17±0.01##0.12±0.03* 0.11±0.03* 0.12±0.02* 4.06 ＜0.05胞漿P65 0.52±0.09 0.86±0.12##0.65±0.13* 0.65±0.12* 0.65±0.08* 3.14 ＜0.05胞漿P50 0.62±0.09 0.96±0.12##0.75±0.13* 0.74±0.12* 0.75±0.08* 3.15 ＜0.05

圖1各組胞漿P-IκBα、P65、P50蛋白含量Western blot檢測電泳圖

2.3各組OECs缺氧/復氧損傷模型胞核P65、P50表達的比較

與正常血清對照組比較，正常血清+低氧組各時間點胞核P65、P50表達均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與正常血清+低氧組比較，低氧+依達拉奉組、低氧+健脾補土組、正常血清+低氧+ PDTC組各時間點胞核P65、P50表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3，圖2。

表3　48 h各組OECs胞核P65、P50表達　（±s，n=3）

表3　48 h各組OECs胞核P65、P50表達　（±s，n=3）

注：與正常血清對照組比較，##P＜0.01；與正常血清加低氧組比較，*P＜0.05。

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圖2各組OECs胞核P65、P50蛋白含量（Western blot檢測電泳圖）

3討論

CIRI屬于中醫(yī)學“中風”范疇，綜觀歷代中醫(yī)對本病的認識，其主要病因病機為風、火、痰、氣、瘀、虛，早在《四圣心源》中就有記載：“中風者，脾虛陽衰，運化失常，水濕內生，脾主四肢，脾氣虧虛，四肢失秉，而外感風邪者也，趁虛而入。實秉氣于脾胃。”導師從細胞外基質（extracell matrixc，ECM）與脾功能相似的角度出發(fā)，認為ECM的功能當歸于中醫(yī)“脾土”功能的范疇［9］，提出了以健脾補土法治療中風后遺癥的觀點，并先后進行了大量的研究。近年來，臨床研究表明使用該法有一定的腦保護作用，能改善智能減退者記憶力、計算能力、定向能力，有利于精神癥狀好轉，提高日常生活自理能力［10］。同時課題組發(fā)現(xiàn)健脾補土法對CIRI大鼠神經(jīng)功能評分有改善，能降低神經(jīng)元凋亡指數(shù)，增加ECM成分層粘連蛋白的表達和減少MMP-9的表達［11］。近期動物實驗研究表明健脾補土法能抑制腦組織NF-κB/P65的表達，促進IκBα的表達，從而改善CIRI大鼠神經(jīng)功能缺損，對CIRI起保護作用，其腦保護機制可能與調節(jié)NF-κB信號通路有關［4］。

OECs稱嗅神經(jīng)成鞘細胞，是存在于嗅球的一種神經(jīng)細胞。嗅球是哺乳類動物一生中能夠支持神經(jīng)再生的唯一中樞神經(jīng)組織［1］。在正常細胞更替過程中或損傷后，一旦出現(xiàn)神經(jīng)細胞死亡，嗅上皮內不斷增殖的干細胞會產(chǎn)生新的神經(jīng)細胞。國外研究表明，OECs能使實驗室去髓鞘損傷的大鼠脊髓再形成髓鞘［3］和支持被切斷的軸突再生［3］。在國內研究中，OEC因其可再生的特性通常被用于治療脊髓損傷，能促進軸突再生，改善患者肢體活動［12］。OECs移植能減輕損傷腦組織病理變化，減少神經(jīng)細胞變性及壞死數(shù)量，緩解腦損傷引起的間質水腫［13］和神經(jīng)功能缺失［14］。因為OECs具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質細胞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)施萬細胞的特性，能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)充分融合，在培養(yǎng)過程中能分泌神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)生長因子等多種營養(yǎng)物質并可能通過旁分泌或靶源性模式作用于神經(jīng)干細胞，促進其增殖［15］。

NF-κB信號通路存在于大部分細胞，不僅調節(jié)著大部分的免疫反應，而且也涉及細胞增殖、癌變和細胞凋亡等［16-17］。它是一種調節(jié)轉錄因子，是由P65 和P50兩個亞單位以不同形式組合成的同源或異源二聚體，而在體內發(fā)揮生理功能的主要是P50-P65二聚體。通常在靜息狀態(tài)下，NF-κB抑制劑IκBα與NF-κB p65、p50兩個亞單位以失活狀態(tài)存在于細胞質中。TAB2和TAB3是NF-κB信號通路中關鍵的信號轉導分子，其C端的鋅指結構域可特異地識別并結合NF-κB通路上游激活所產(chǎn)生的泛素鏈，從而促進TAK1激酶的磷酸化［18］。當腦缺血損傷激活NF-κB抑制蛋白激酶（IκK）后，活化的IκK會泛素化、磷酸化并降解IκBα，使得NF-κB兩個亞單位從失活狀態(tài)活化，并從細胞質轉移到細胞核內，與相應的炎癥相關基因結合，啟動炎性細胞因子轉錄，誘發(fā)炎癥，參與腦缺血損傷。腦缺血后NF-κB持續(xù)增加，并且在垂死的神經(jīng)元中持續(xù)活化，通過一些可能的途徑來誘導細胞死亡，其中包括生成死亡蛋白和重新進入細胞周期失敗。NF-κB的激活能促進Bax及Caspase3的表達，降低Bcl-2的表達來促進炎癥反應的進行及神經(jīng)細胞的凋亡［19］，它可能通過調節(jié)神經(jīng)再生功能來影響腦外傷引起的神經(jīng)功能損害［20］，所以有可能通過抑制腦缺血后NF-κB的過度表達，減少炎癥因子生成，減輕腦缺血損傷［21］。本實驗研究結果表明，與正常血清對照組比較，低氧損傷組細胞胞漿p-IκBα增加，胞漿和胞核P65、P50顯著增加，提示當細胞受到缺氧的刺激時，胞漿NF-κB抑制劑IκBα被磷酸化降解，對P65、P50抑制作用減弱，P65、P50從胞漿轉位入胞核增加，且表達增強。健脾補土組含藥血清組胞漿p-IκBα降低，胞漿和胞核P65、P50顯著降低，提示其對NF-κB的活化具有抑制作用。

綜上所述，健脾補土法組方可能通過抑制OECs缺氧/復氧損傷過程中 IκBα磷酸化，抑制P65、P50的過度表達，抑制NF-κB通路的活化，減少OECs的缺氧/復氧損傷，發(fā)揮對CIRI神經(jīng)細胞損傷的保護作用。

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（本文編輯楊瑛）

Effect of Spleen-Strengthening Therapy Contained Serum on P65，P50 and P-IκBα Expression in Olfactory Ensheathing Cells with Hypoxia/Reoxygenation Injury Models

LI Lutiao，LIU Wanghua*，LI Hua，PENG Zhiyuan，ZHOU Cuiling，F(xiàn)U Xiaojin
（Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China）

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.08.005

2016-03-18

國家自然科學基金（81202632、81473567），教育部博士點基金（20124323120003），湖南省自然科學基金（13JJ3097），湖南省教育廳科研項目（14B134、15K092）。

李路迢，女，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)心腦血管病證治研究。

*劉旺華，男，副教授，碩士研究生導師，E-mail：595413533@qq.com。