兩種純化工藝對大黃水提液中蒽醌類成分的影響研究

張　馳，夏新華*，周莉莉，李　朝，周　宇

（湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208）

·文獻綜述·

兩種純化工藝對大黃水提液中蒽醌類成分的影響研究

張馳，夏新華*，周莉莉，李朝，周宇

（湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208）

目的 探索殼聚糖絮凝澄清工藝與醇沉工藝對大黃水提液中蒽醌類成分的影響規律。方法 以大黃中5種蒽醌類成分的保留率為評價指標，考察兩種純化工藝在不同條件下對大黃水提液中蒽醌類成分的影響。結果 兩種純化工藝在不同的條件下，大黃水提液中5種蒽醌類成分的保留率大小幾乎具有一致的規律，即大黃酸＞蘆薈大黃素＞大黃素＞大黃酚＞大黃素甲醚，醇沉工藝對于大黃蒽醌類成分的保留率優于殼聚糖絮凝澄清工藝。結論 醇沉工藝對極性小的成分的保留優于殼聚糖絮凝澄清工藝，而對極性高的成分的保留則相反。

大黃；蒽醌類；殼聚糖；絮凝澄清；醇沉

〔Abstract〕Objective To explore the effect laws of chitosan flocculation clarification and alcohol precipitation process on the anthraquinones in aqueous extract solution of Rheum palmatum.Methods The retention rates of five anthraquinones in Rheum palmatum are as evalution indexes，the influences of two purification processes under the different conditions on the anthraquinones were investigated.Results Under the different conditions of two purification processes，the retention rates of five anthraquinones in aqueous extract solution of Rheum palmatum almost had the same laws：rhein＞aloe emodin＞emodin＞chrysophanol＞emodin methyl ether.Comparing two purification processes，the retention rates of alcohol precipitation process on anthraquinones were superior to ones of chitosan flocculation clarification process.Conclution The retention rates of low polarity constituents by alcohol precipitation were better than the chitosan flocculation clarification process，while the high polarity constituents were opposite.

〔Keywords〕Rheum palmatum；anthraquinones；chitosan；flocculation clarification；alcohol precipitation

相對于傳統的水提醇沉法，絮凝澄清法用于中藥水提液的純化具有操作簡單、澄清劑用量小、能耗低等優點［1］，因而近年受到許多中藥制劑工作者的極大關注。本課題組前期研究發現，殼聚糖絮凝澄清工藝對水提液中極性大的成分的保留優于醇沉工藝，對中等極性成分的保留與醇沉工藝相近，而對極性小的成分的保留則差于醇沉工藝［2-4］。大黃為臨床常用中藥，主含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等蒽醌類有效成分［5-6］。有關上述兩種純化方法對大黃成分的影響研究目前已有一些報道，研究結果顯示二者均可造成上述大黃蒽醌類成分不同程度的損失［7-8］，但未見系統考察上述兩種純化方法的不同工藝條件對大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素等成分的影響規律。為進一步探討醇沉工藝與殼聚糖絮凝澄清工藝對中藥水提液中有效成分的影響規律，并探索大黃水提液合適的純化工藝，本文系統地考察了兩種純化工藝對大黃水提液中所含5種主要蒽醌類成分的影響并進行了對比。

1儀器與試藥

Waters 1525型高效液相色譜儀 （美國Waters公司），Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5μm），YD601N型電子天平（上海恒平科學儀器有限公司），SHZ-Ⅲ型循環水試藥式真空泵（上海亞榮生化儀器廠），KQ5200BE型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

對照品大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110757-200206、110756-200110、110757-201210、110758-201415、110795-201308，供含量測定用），純凈水（怡寶），其余試劑為色譜純。

大黃飲片購自長沙市東塘藥店，經湖南中醫藥大學中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.。

2方法和結果

2.1大黃蒽醌類成分的含量測定

2.1.1色譜條件采用Kromasil C18色譜柱，以甲醇-0.4%冰醋酸溶液為流動相進行梯度洗脫 （見表1）；流速：0.8 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；進樣量為20 μL。

表1梯度洗脫程序

2.1.2混合對照品溶液的制備精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，加甲醇溶解并定容，制成蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚質量濃度分別為25.0、43.0、60.0、100.0、50.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備與測定精密量取大黃水提純化液5mL，過0.45μm微孔濾膜，取續濾液作為供試品溶液。精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定。

2.1.4線性關系考察分別吸取上述混合對照品溶液10、12、14、16、18、20 μL，注入液相色譜儀，以對照品質量濃度對峰面積進行線性回歸，得回歸方程分別為：Y蘆薈大黃素=4 678x+84 950（r=0.999 6），Y大黃酸=7 091.7x+48 311（r=0.999 3），Y大黃素=5 065x+80 810（r=0.999 1），Y大黃酚=8 772.7x-208 682（r=0.999 4），Y大黃素甲醚=3 400.3x-2 206.3（r=0.999 8），其線性范圍分別為0.9～16.8 mg/L、0.1～18.9 mg/L、1.2～23.6 mg/L、0.9～20.0 mg/L、0.9～11.7 mg/L。

2.1.5精密度試驗精密稱取同一批大黃水提純化液樣品5 mL，按“2.1.1”項下方法依法測定5種蒽醌成分的含量，連續進樣6次，結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的相對峰面積的RSD均在0.40%～2.99%之內，表明實驗儀器精密度良好。

2.1.6穩定性試驗取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于配置后0、4、8、16、24、36 h進樣，結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積 RSD分別為 1.89%、1.87%、1.78%、1.66%、1.89%，說明5種成分在36 h內穩定。

2.1.7重復性試驗精密量取同一批號的大黃水提純化液樣品5 mL，共6份，按“2.1.1”項下方法依法測定5種蒽醌成分的含量，結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為1.59%、1.69%、1.68%、1.86%、1.72%，表明該方法重復性良好。

2.1.8加樣回收率試驗精密量取已知含量的大黃水提純化液樣品2.5 mL，共6份，分別精密加入適量對照品溶液，混勻，按“2.1.1”項下方法依法測定5種蒽醌成分的含量，結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的加樣回收率分別為97.1%、96.3%、97.5%、96.4%、95.9%，表明該方法可行。

2.2大黃水提液的制備

取大黃粗粉適量，加水浸泡0.5 h，第一次加10倍量水煎煮2 h，第二次加8倍量水煎煮1.5 h，濾過，收集兩次水提液，備用。

2.3醇沉工藝對大黃蒽醌類成分的影響

2.3.1藥液相對密度的考察取大黃水提液適量，真空濃縮至相對密度為1.20（60℃），取濃縮液3等份（每份含大黃50 g），其中2份加水分別稀釋至相對密度約為1.15、1.10（60℃），放冷，攪拌下分別緩緩加入計算量的95%乙醇使含醇量為60% （g/g），靜置24 h，濾過，收集濾液，定容，然后過0.45 μm的微孔濾膜，取續濾液作為供試品溶液，按“2.1.1”項下方法測定蒽醌類成分的含量。對實驗數據進行雙因素方差分析，結果表明3種不同濃度的大黃溶液經醇沉處理后其5種大黃蒽醌成分的保留率差異明顯（P＜0.01），以濃度最低者（相對密度1.10）為佳；而5種大黃蒽醌成分之間的保留率在各種濃度下均存在較大差異（P＜0.01），其保留率大小依次為：大黃酸＞蘆薈大黃素＞大黃素＞大黃酚＞大黃素甲醚（見表2）。

表2醇沉法藥液相對密度對5種大黃蒽醌成分保留率的影響

2.3.2藥液含醇量的考察取上述相對密度1.20 （60℃）的大黃濃縮液適量，共6份（每份含大黃50 g），加水分別稀釋至相對密度約為 1.15 （60℃），攪拌下分別緩緩加入計算量的95%乙醇使含醇量為40%、50%、60%、70%、80%、90%，靜置24 h，濾過，收集濾液，定容，按“2.3.1”項下方法操作。對實驗數據進行雙因素方差分析，結果表明大黃溶液經不同濃度的醇處理后其5種大黃蒽醌成分的保留率差異明顯（P＜0.01），且隨著藥液含醇量升高，5種大黃蒽醌成分的保留率均呈遞增趨勢（P＜0.01），結果見表3。

表3醇沉法藥液含醇量對5種大黃蒽醌成分保留率的影響

2.4殼聚糖絮凝澄清工藝對大黃蒽醌類成分的影響

2.4.1藥液濃度的考察取上述大黃水提液適量，共5份，分別濃縮至生藥與藥液比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g∶mL），調節pH至6，于水浴上70℃恒溫，在 400 r/min的攪拌條件下按每 1g生藥加入1.5 mL的1%殼聚糖溶液 （用1%HAc配制），攪拌10 min，靜置24 h，濾除絮凝物，收集濾液，定容，按“2.3.1”項下方法操作。對實驗數據進行雙因素方差分析，結果表明5種不同濃度的大黃溶液經殼聚糖絮凝澄清法處理后其5種大黃蒽醌成分的保留率差異明顯（P＜0.01），當藥液的生藥-藥液比為1∶4～1∶5時，5種大黃蒽醌成分的保留率相對較高（P＜0.01），結果見表4。

表4絮凝法藥液濃度對5種大黃蒽醌成分保留率的影響

2.4.2藥液pH考察取大黃水提液濃縮至生藥與藥液比為1∶4，取5等份，分別調節 pH為4、5、6、7、8，于水浴上70℃恒溫，以下操作同“2.4.1”項下方法。對實驗數據進行雙因素方差分析，結果表明5種不同pH的大黃溶液經殼聚糖絮凝澄清法處理后其5種大黃蒽醌成分的保留率差異明顯（P＜0.01），當藥液pH為6時，5種大黃蒽醌成分的保留率相對較高（P＜0.01），結果見表5。

表5絮凝法藥液pH對5種大黃蒽醌成分保留率的影響

2.4.3殼聚糖用量的考察取大黃水提液濃縮至生藥與藥液比為1∶4，調節pH為6，取3等份，于水浴上70℃恒溫，在400 r/min的攪拌條件下加不同量的1%殼聚糖溶液，以下操作同“2.4.1”項下方法。對實驗數據進行雙因素方差分析，結果表明加入不同量的殼聚糖處理大黃溶液后其5種大黃蒽醌成分的保留率差異明顯（P＜0.01），當藥液中加入的殼聚糖的量為每克生藥1.0 mL時，5種大黃蒽醌成分的保留率相對較高（P＜0.01），結果見表6。

表6殼聚糖用量對5種大黃蒽醌成分保留率的影響

2.4.4藥液溫度的考察取大黃水提液濃縮至生藥與藥液比為1∶4，調節 pH為6，取3等份，分別于水浴上50℃、70℃、90℃恒溫，以下操作同“2.4.1”項下方法。對實驗數據進行雙因素方差分析，結果表明大黃溶液在不同溫度下經殼聚糖絮凝澄清法處理后其5種大黃蒽醌成分的保留率差異明顯（P＜0.01），當藥液溫度為50℃時，5種大黃蒽醌成分的保留率相對較高（P＜0.01），見表7。

表7絮凝法藥液溫度對5種大黃蒽醌成分保留率的影響

2.5殼聚糖絮凝澄清工藝與醇沉工藝的比較

取大黃水提液適量，真空濃縮至相對密度為1.10（60℃），取3等份，放冷，攪拌下分別緩緩加入95%乙醇使含醇量為 70%（g/g），靜置 24 h，按“2.3.1”項下方法操作。另取大黃水提液適量，真空濃縮至生藥與藥液比為1∶4，調節 pH至6，取3等份，于水浴上50℃恒溫，在400 r/min的攪拌條件下按每1 g生藥加入1.0 mL的1%殼聚糖溶液，以下操作同“2.4.1”項下方法。對實驗數據進行t-檢驗，結果表明以5種大黃蒽醌成分保留率為評價指標，采用醇沉法處理大黃水溶液明顯優于殼聚糖絮凝澄清法。見表8。

表8兩種純化工藝的大黃蒽醌類成分保留率　　（x，n=3）

3小結與討論

采用醇沉法處理大黃水提濃縮液，藥液濃度與含醇量對蘆薈大黃素、大黃酸等5種大黃蒽醌成分的保留率均有明顯的影響。實驗表明，藥液濃度較低、含醇量較高時，有助上述5種大黃蒽醌成分的保留，這可能與藥液濃度低時醇沉藥液體積相對增大及高濃度乙醇對難溶于水的大黃蒽醌類成分具有較好的溶解性有關。

采用殼聚糖絮凝澄清法處理大黃水提濃縮液，藥液濃度、pH、溫度及殼聚糖用量對蘆薈大黃素、大黃酸等5種大黃蒽醌成分的保留率均有明顯的影響，其中溫度、殼聚糖用量對保留率的影響具有一定的規律性，即在考察范圍內隨溫度的升高和殼聚糖用量的增加，上述蒽醌成分保留率呈現遞減趨勢，這說明大黃蒽醌成分對熱不穩定，應注意控制絮凝的溫度，另外應控制作為絮凝劑的殼聚糖用量。

比較大黃中5種蒽醌類成分在不同試驗條件下的保留率，不難發現無論大黃水提液是采用醇沉法還是殼聚糖絮凝澄清法進行處理，它們的保留率大小幾乎具有一致的規律，即大黃酸＞蘆薈大黃素＞大黃素＞大黃酚＞大黃素甲醚，其中大黃酸的保留率在各種試驗條件下均遠高于大黃素甲醚。對上述5種成分的結構進行分析，根據它們母核上的取代基的極性大小不同，可以推測上述大黃蒽醌成分的極性大小與上述它們在純化過程中的保留率大小順序是一致的［5-6］，這表明大黃蒽醌類成分本身的結構與極性大小亦是純化過程中影響其保留率的主要因素。以上述極性大小不同的5種大黃蒽醌成分為指標，對比醇沉法與殼聚糖絮凝澄清法，可以發現無論哪一種方法均難以使大黃水提液在純化中使所有的成分均達到很好的保留，但醇沉法對大黃上述5種蒽醌成分的保留率總體優于殼聚糖絮凝澄清法，這可能與所考察的5種大黃蒽醌成分在性質上總體屬于低極性成分（脂溶性強）有關。這一結果與我們前期的研究發現是一致的［2-4］，但與文獻報道稍有不同（可能與其醇沉工藝采用50%醇濃度低于本實驗70%醇濃度有關）［7］。因此，對中藥水提液進行純化處理時，要特別注意有效成分的理化性質，并考慮采用多指標進行評價，以便選擇合理的純化方法，避免中藥有效成分在純化中大量損失而影響藥效。

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（本文編輯蘇維）

Influences of Two Purification Processe on Anthraquinones in Aqueous Extract Solution of Rheum palmatum

ZHANG Chi，XIA Xinhua*，ZHOU Lili，LI Chao，ZHOU Yu
（School of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China）

R283

B

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.08.008

2016-03-24

國家自然科學基金面上項目（30973955）。

張馳，女，在讀碩士研究生，從事中藥新制劑及制劑質量標準的研究。
〔通迅作者〕*夏新華，男，博士，教授，博士研究生導師，E-mail：xiaxinhua001@163.com。