白子菜提取物對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型抗炎作用的研究

劉昌盛，陳　昉，何　穎，李桂元，姚　紅，童　娟*

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

白子菜提取物對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型抗炎作用的研究

劉昌盛，陳昉，何穎，李桂元，姚紅，童娟*

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510120）

目的 探討白子菜提取物對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型抗炎作用。方法 將72只Wistar大鼠隨機分為9組（每組8只）：空白組、模型組、秋水仙堿組、白子菜水提取物低、中、高劑量組、白子菜醇提取物低、中、高劑量組。造模5 h后開始連續(xù)灌藥，7 d后取材，觀察各組大鼠關(guān)節(jié)炎癥情況，關(guān)節(jié)組織單位面積內(nèi)炎癥細(xì)胞計數(shù)及檢測血清白介素-1β（interleukin-1 β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）濃度。結(jié)果 中、高劑量白子菜提取物組與秋水仙堿組在足趾炎癥情況顯著低于模型組（P＜0.05）。在淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞計數(shù)方面各藥物組顯著低于模型組（P＜0.05），各藥物組間無明顯差異（P＞0.05）。秋水仙堿組TNF-α表達水平顯著低于模型組（P＜0.05）。秋水仙堿組及白子菜醇提取物中劑量組IL-1β表達水平顯著低于模型組（P＜0.05）。結(jié)論 秋水仙堿及中劑量白子菜醇提物對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)大鼠模型具有抗炎免疫作用。

白子菜提取物；急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；抗炎免疫作用

〔Abstract〕Objective To explore the anti-inflammatory of Gynura divaricata（Linn.）DC.extract on rat models with acute gouty arthritis.Methods Seventy-two Wistar rats were randomly divided into nine groups（eight rats in each group）：blank group，model group，colchicines group，ethanol extract of G.divaricata groups（high-dose group，middle-dose group and low-dose group），water extract of G.divaricata Groups（high-dose group，middle-dose group，low-dose group）.After 5 h of modeling，the rats were given medicine continously.After 7 d of treatment，the inflammatory cells among joint tissue and the concentrations of IL-1β，TNF-α from serum were observed and determined.Results The foot inflammation condition of G.divaricata extract groups（high-dose and middle-dose）and colchicines group were significantly lower than that of model group （P＜0.05）.The lymphocytes，neutrophils among joint tissue in the medicine intervention groups were significantly lower than that of model group（P＜0.05）and there were no significantly difference between each of the two medicine intervention groups （P＞0.05）.The expression of TNF-α in the colchicines group was significantly lower than that in the model group（P＜0.05）. The expression of IL-1β in G.divaricata ethanol-extract groups and colchicines group were significantly lower than that of model group（P＜0.05）.Conclusion Colchicines and G.divaricata ethanol-extract group of middle-dose show significant anti-inflammatory effect on rat models with acute gouty arthritis.

〔Keywords〕Gynura divaricata（Linn.）DC.extract；acute gouty arthritis；anti-inflammatory and immunity effect

痛風(fēng)（gout）是一種單鈉尿酸鹽沉積所致的晶體相關(guān)性關(guān)節(jié)病，屬于代謝性風(fēng)濕病范疇［1］。白子菜是菊科植物白子菜Gynura divaricata（L.）DC.的全草。別名白仔菜、白背三七等。分布于我國南方各省區(qū)，主產(chǎn)于廣西壯族地區(qū)，有清熱解毒、活血化瘀、祛風(fēng)消腫之功效［2］。民間廣泛用于高血壓、糖尿病、高脂血癥、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等疾病，有“神仙草”之稱［3］。現(xiàn)代研究表明，本品具有降血糖、抗誘變、降血壓、降血脂、消炎等作用［4-9］。本課題組已對白子菜在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的臨床防治效果進行初步觀察，發(fā)現(xiàn)其對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有抗炎止痛的作用。故在此基礎(chǔ)上，觀察白子菜在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型抗炎免疫作用，以確定白子菜對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療效果及起效成份。

1材料

1.1實驗動物

SPF級雄性wistar大鼠72只（中山大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2011-0029，體質(zhì)量200～250 g，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室 （使用許可證號為SYXK（粵）2010-0104）。

1.2主要藥品及試劑

白子菜采自廣州番禺區(qū)蓮花山下農(nóng)田，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中藥鑒定教研室陳興興鑒定為菊科土三七屬植物白子菜Gynura Divaricata（L.）DC.的地上部分，曬干備用。白子菜水提取液用8倍量水提取2次，第一次2 h，第二次1.5 h，濾過合并兩次濾液濃縮至0.5、0.25、0.125 g/mL三種濃度備用，白子菜醇提取液用8倍量75%乙醇提取2次，第一次2 h，第二次1.5 h。合并兩次濾液濃縮至1、0.5、0.25 g/mL三種濃度備用。秋水仙堿（批號20131101，廣東彼迪藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）。尿酸鈉 （美國sigma公司，批號：U2875-5G）；白介素-1β（interleukin-1 β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）試劑盒（美國RayBio公司）。

1.3主要儀器

TL4型偏振光高倍顯微鏡，日本OLYMPUS公司生產(chǎn)；5810R型高速冷凍離心機，德國 EPPNDORF公司上產(chǎn)；DG5033A型酶標(biāo)儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；9700型聚合酶鏈反應(yīng)擴增儀，美國ABI公司生產(chǎn)；7500H型qPCR儀，美國INVITROGEN公司生產(chǎn)；BL-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，成都泰盟軟件有限公司生產(chǎn)。

2方法

2.1尿酸鈉結(jié)晶及尿酸鈉溶液制備

根據(jù)Coderre記載方法改進［10］。具體過程：無菌條件下將 800 mg尿酸鈉和 155 mL生理鹽水、1 mol/L的NaOH溶液5 mL混合，置于燒瓶中加熱煮沸至尿酸鈉完全溶解，停止加熱后迅速小滴滴入1 mol/L的無菌鹽酸，出現(xiàn)不溶白色絮狀沉淀即可終止滴加，自然降至室溫后于4℃、3 000 r/min離心至晶體不再析出后，棄上清，將晶體混懸于無菌緩沖液中配成所需濃度，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫Ｖ辜訜岷蟊３譄o菌操作。鏡下可見大量單個骨針狀結(jié)晶。

2.2造模、分組及給藥方法

wistar大鼠72只先分為空白組及造模組，造模組參照改良后的Cdoerre大鼠動物模型造模方法進行造模［10］。大鼠腹腔注射水合氯醛（30 mg/kg）麻醉，選受試大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)，常規(guī)消毒后，用5號注射針與脛骨成45°方向刺入左側(cè)踝關(guān)節(jié)，除空白組予0.1 mL無菌緩沖液外，其他8組予0.1 mL尿酸鈉溶液（50 mg/mL）注入到踝關(guān)節(jié)腔，形成急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。造模成功后按體重隨機分為模型組，秋水仙堿組，白子菜水提取物低劑、中、高劑量組，白子菜醇提取物低、中、高劑量組。根據(jù)人、大鼠藥物劑量換算公式［11］，予秋水仙堿溶液0.2 mg/（kg·d）白子菜水提取物低劑量組2.5 g/（kg·d）、白子菜水提取物中劑量組5 g/（kg·d）、白子菜水提取物高劑量組10 g/（kg·d）、白子菜醇提取物低劑量組5 g/（kg·d）、白子菜醇提取物中劑量組10 g/（kg·d）、白子菜醇提取物高劑量組20 g/（kg·d）。造模5 h后各組予相應(yīng)濃度藥物20 mL/kg初次灌胃，空白組及模型組予20 mL/kg滅菌水灌胃，其后每天1次，共7次。

2.3觀測指標(biāo)

2.3.1急性關(guān)節(jié)炎癥狀觀測根據(jù)Coderre炎癥指數(shù)及功能障礙指數(shù)分級評定標(biāo)準(zhǔn)［10］設(shè)定，炎癥指數(shù)評定：0級，正常；1級，左后足關(guān)節(jié)皮膚紅斑，輕度腫脹，骨性標(biāo)志可見；2級，左后足關(guān)節(jié)明顯紅腫，骨性標(biāo)志消失，但腫脹局限于關(guān)節(jié)部位；3級，左后足關(guān)節(jié)以外肢體腫脹。功能障礙指數(shù)評定：0級，正常步態(tài)，四足均勻著地；1級，左后足著地減輕，足趾未展開，輕度跛行；2級，左后足屈起，趾背著地，明顯跛行；3級，左后足完全離地，呈三足步態(tài)。足腫脹度評定：用足容積測量儀測量，精確到0.1 mL。以上指標(biāo)在造模前、造模后5 h及其后每天灌胃前評估，共7次。

2.3.2大鼠關(guān)節(jié)組織單位面積炎癥細(xì)胞計數(shù)末次灌胃3 h后水合氯醛30 mg/kg腹腔麻醉取材，取下關(guān)節(jié)組織后，10%甲醛固定48 h，脫鈣劑脫鈣72 h，逐級乙醇脫水，二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋，常規(guī)切片4 μm，HE染色。在光學(xué)顯微鏡400倍鏡下選取炎癥細(xì)胞最密集區(qū)域，依托BL-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)定量觀察關(guān)節(jié)軟組織及關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥細(xì)胞聚集情況，計數(shù)單個鏡下視野內(nèi)淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞及漿細(xì)胞數(shù)。

2.3.3大鼠血清IL-1β、TNF-α表達檢測末次灌胃3 h后水合氯醛30 mg/kg腹腔麻醉下抽取上腔靜脈血4 mL，靜置2 h，4℃下3 000 r/min離心15 min，留取血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作檢測并計算IL-1β、TNF-α濃度。

2.4統(tǒng)計方法

采用SPSS 18統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。檢測數(shù)據(jù)均采用“±s”表示。滿足正態(tài)分布的計量資料組間比較采用One-Way ANOVA檢驗，總體分布非正態(tài)分布的兩組等級資料采用Wilcoxon秩和檢驗，多組等級資料比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1各組大鼠炎癥指數(shù)、功能障礙指數(shù)、足腫脹度比較

造模后第一天各大鼠炎癥指數(shù)、功能障礙指數(shù)、足腫脹度均顯著高于空白組（P＜0.05），而各造模組間無明顯差異（P＞0.05），提示造模成功。關(guān)節(jié)活動情況變化總體趨勢為：造模后24～48 h大鼠關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)、功能障礙指數(shù)及足腫脹度達高峰，出現(xiàn)明顯的造模關(guān)節(jié)局部皮膚發(fā)紅、皮溫升高、關(guān)節(jié)腫脹、運動障礙，并且致炎癥狀在達高峰后逐漸下降。炎癥指數(shù)方面，造模第七天模型組顯著高于空白組、白子菜醇提取物高劑量組、白子菜水提取物高劑量組及秋水仙堿組 （P＜0.05）并且這四組間無顯著性差異 （P＞0.05）。功能障礙指數(shù)方面，造模第七天各組間均無顯著性差異（P＞0.05）。而足腫脹度方面，造模第七天模型組顯著高于白子菜醇提取物高劑量組 （P＜0.05），其余各組與空白組、模型組間均無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1各組大鼠炎癥指數(shù)、功能障礙及足趾腫脹度變化比較　　（±s，n=8）

表1各組大鼠炎癥指數(shù)、功能障礙及足趾腫脹度變化比較　　（±s，n=8）

注：與空白組比較*P＜0.05；與模型組比較#P＜0.05。

3.2各組大鼠關(guān)節(jié)組織單位面積炎癥細(xì)胞計數(shù)

淋巴細(xì)胞方面，模型組及水提低劑量組顯著高于空白組（P＜0.05），而其他各組均顯著低于模型組（P＜0.05）。肥大細(xì)胞計數(shù)方面，水提中劑量組顯著高于空白組（P＜0.05）。結(jié)果見表2。常規(guī)HE染色病理切片顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)，模型組單位面積可見大量淋巴細(xì)胞浸潤，而中性粒細(xì)胞則較少，白子菜水提及醇提中、高劑量治療組相對于低劑量組炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯減少。見圖1。

3.3各組大鼠血清IL-1β、TNF-α濃度比較

模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α濃度均顯著高于空白組（P＜0.05）；醇中組及秋水仙堿組中大鼠血清IL-1β濃度顯著低于模型組（P＜0.05），秋水仙堿組大鼠血清TNF-α濃度顯著低于模型組（P＜0.05）。其余各組分別與模型組及空白組比較無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2各組大鼠關(guān)節(jié)組織單位面積炎癥細(xì)胞計數(shù)、血清IL-1β、TNF-α濃度比較　　（±s，n=8）

表2各組大鼠關(guān)節(jié)組織單位面積炎癥細(xì)胞計數(shù)、血清IL-1β、TNF-α濃度比較　　（±s，n=8）

注：與空白組比較*P＜0.05；與模型組比較#P＜0.05。

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圖1各組大鼠關(guān)節(jié)組織改變病理學(xué)光鏡圖（HE，×400）

4討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是一個復(fù)雜的慢性炎性組織反應(yīng)，與機體抗炎免疫密切相關(guān)。免疫系統(tǒng)主要分為天然免疫和適應(yīng)性免疫兩大類。其中急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是以IL-1β為核心的天然免疫為主導(dǎo)作用，適應(yīng)性免疫則因能夠產(chǎn)生免疫記憶效應(yīng)，在炎癥的持續(xù)階段起主導(dǎo)作用。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作初期，首先是激發(fā)天然免疫使得單核細(xì)胞進入組織炎癥部位，逐漸發(fā)展成為成熟的巨噬細(xì)胞吞噬MSU晶體并募集中性粒細(xì)胞，單核/巨噬細(xì)胞直接合成和分泌炎性因子如IL-1β、TNF-α等，其中IL-1β是一個公認(rèn)的重要的巨噬細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子，是最重要的炎癥細(xì)胞因子之一，大量IL-1β聚集有確切的致炎作用。除巨噬細(xì)胞外，許多類型的細(xì)胞均可產(chǎn)生IL-1β，包括肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。中性粒細(xì)胞的活化在“痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性發(fā)作的二期”延續(xù)反應(yīng)中起重要作用，其浸潤程度與急性炎癥程度正相關(guān)，IL-1β的激活釋放往往緊隨其后。在關(guān)節(jié)，IL-1β以自分泌方式刺激其他細(xì)胞因子的合成，其中包括TNF-α。而淋巴細(xì)胞則在啟動和維持免疫炎癥反應(yīng)方面起重要作用，故在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎后期扮演重要角色，是評估炎癥消退水平的重要指標(biāo)［12］。故本研究選取密切相關(guān)的淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞及IL-1β、TNF-α作為觀測指標(biāo)探討。

研究結(jié)果顯示，中、高劑量白子菜提取物與秋水仙堿對緩解急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥情況同樣有效，從所得數(shù)據(jù)看，隨著提取物劑量的增加，各觀察指標(biāo)改善程度越大，在研究中對各造模組大鼠關(guān)節(jié)組織病理切片用400倍鏡進行觀察，單位面積均可見大量淋巴細(xì)胞浸潤，而中性粒細(xì)胞則較少，提示造模第7天時大鼠模型處于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎后期。研究結(jié)果顯示白子菜醇提、水提中高劑量及秋水仙堿組均能顯著抑制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型局部淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞相關(guān)炎癥反應(yīng)，可認(rèn)為白子菜醇提、水提中高劑量及秋水仙堿藥物組對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的急性炎癥均有明確抗炎免疫作用。在對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型血清IL-1β、TNF-α表達的研究結(jié)果顯示模型組顯著高于空白組，提示急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎存在上述因子相關(guān)的系統(tǒng)性炎癥。同時本研究結(jié)果顯示，醇中組及秋水仙堿組中血清IL-1β濃度均顯著低于模型組，提示中劑量白子菜醇提物秋水仙堿同樣能有效抑制炎癥相關(guān)因子IL-1β的表達，其濃度差異性結(jié)果提示藥物性、療效與藥物成分有相關(guān)性，TNF-α濃度在秋水仙堿組顯著低于模型組，提示秋水仙堿能有效抑制TNF-α的表達，各白子菜提取物組表達量較模型組低，但無明顯差異，提示白子菜提取物存在抑制TNF-α表達的機制，但與秋水仙堿不全相同。在抗炎免疫作用的機制方面，IL-1β與TNF-α表達量變化的不同步均提示同種藥物對兩者的抑制機制亦存在差異，但其機制在本研究中未能闡明，有待進一步研究探討。

通過本次研究得出，白子菜醇提及水提中高劑量藥物組對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型有抗炎作用，能夠不同程度加速急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥狀緩解進程，白子菜醇提及水提藥物劑量高低與作用效果具有相關(guān)性，此研究為藥物有效成分的篩選提供思路。

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（本文編輯楊瑛）

Anti-inflammatory Effect of Gynura divaricata（Linn．）DC．Extract on Rat Models with Acute Gouty Arthriti

LIU Changsheng，CHEN Fang，HE Ying，LI Guiyuan，YAO Hong，TONG Juan*
（The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou，Guangdong 510120，China）

·中藥制劑·

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.08.007

2015-04-28

劉昌盛，男，學(xué)士，技師，從事骨關(guān)節(jié)病中醫(yī)藥防治研究。

*童娟，女，博士，主任醫(yī)師，E-mail：1160739011@qq.com。