光損傷對大鼠血-視網膜屏障功能的影響

王小婷，徐國興，徐　巍，謝茂松

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光損傷對大鼠血-視網膜屏障功能的影響

王小婷1，徐國興2，徐巍2，謝茂松2

1Teaching Center for Clinical Skill, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China;2Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350003, China

Correspondence to:Guo-Xing Xu. Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350003, China. fjmuxgx@163.com

Received：2016-03-09Accepted：2016-07-07

?AIM: To investigate the influence on blood-retina barrier after intense light exposure in rats.

?METHODS: The rats were randomly divided into light exposure group and control group. Rats in light exposure group were exposed in white light (10000lux,12h on-off, continuing 1-14d) . Rats in control group were only exposed in natural light. The eyes of the rats in the two groups were removed when the rats in light exposure group acceptted intense light after 1, 3, 7 and 14d. We observed the change of retinal structure using hematoxylin-eosin (HE) staining, and observed the change of retinal ultrastructure using electron microscope. We quantified the change of retinal vascular permeability using laser scanning confocal fluorescence microscope and spectrophotometry after perfusion of Evans-blue, to evaluate the change of blood-retinal barrier.

?RESULTS: At 1d after intense light exposure, the retinal ultrastructure of rats changed, such as denaturation of photoreceptor cells and falling of membranous disc outer segment and thinning of the outer nuclear layer thickness, and so on; and the longer the rats exposure to intense light, the more serious change of the retinal ultrastructure were found. At 3d later, photoreceptor cells began apoptosis. At 14d later, the outer nuclear layer became thinner obviously, and the number of cells reduce obviously. At 1d after intense light exposure, EB leaked from the retinal vascular, and at 14d later the leaking of EB was more obvious.

?CONCLUSION: The photoreceptor cell of the outer nuclear layer of retina will degenerate and apoptosis, and the outer nuclear layer will be thinner, and the structure and function of blood-retinal barrier will be destroied, if the eyes of rats exposed in intense light.

Citation:Wang XT, Xu GX, Xu W,etal. Effect of light damage on the function of blood-retinal barrier in rats.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(8):1435-1438

摘要

目的：探討強光對大鼠血-視網膜屏障功能的影響。

方法：大鼠隨機分為光照組及對照組，光照組大鼠經散瞳后進行10000lx強光照射(12h光照，12h避光，連續1～14d)，對照組只接受自然光線照射。分別于強光照射后第1、3、7、14d摘除相應的光照組和對照組大鼠雙側眼球；并用HE染色觀察視網膜各層結構變化，用電鏡觀察視網膜超微結構變化，用伊凡思藍(Evans blue，EB)灌注后激光共聚焦顯微鏡下微循環成像及分光光度法定量檢測視網膜微循環通透性變化，來評估血-視網膜屏障變化。

結果：大鼠在強光照射1d后就出現視網膜光感受器細胞變性、外節膜盤脫落、外核層厚度變薄等超微結構改變，并隨著強光照射持續而逐漸加重，3d后出現光感受器細胞凋亡，至14d時外核層厚度已明顯變薄、細胞數也明顯減少。大鼠在強光照射1d后視網膜血管就出現EB染料滲漏，至14d時EB染料滲漏最明顯。

結論：強光照射可導致大鼠視網膜外核層光感受器細胞變性、凋亡，外核層厚度變薄、細胞數減少，血-視網膜屏障結構、功能破壞。

關鍵詞：視網膜光損傷；血-視網膜屏障；細胞凋亡

引用：王小婷，徐國興，徐巍，等.光損傷對大鼠血-視網膜屏障功能的影響.國際眼科雜志2016;16(8):1435-1438

0引言

正常光線刺激視網膜后，通過復雜神經傳導后產生了視覺。如果光照強度或光照時間超過了視網膜的承受力，就可能造成視網膜損傷，從而影響視力。近年來由于手機、電腦等電子產品廣泛應用，由此導致視網膜損傷的病例越來越多,這促使人們對人工光源造成的視網膜損傷越來越關注。有研究發現，光損傷視網膜后的病理變化與年齡相關性黃斑變性及視網膜色素變性的病理變化有許多相似之處，可見光損傷機制在諸多眼底疾病中有著重要作用。因此對視網膜光損傷機制的深入研究有著重要的臨床意義和社會價值。本文研究強光照射對大鼠視網膜結構及血-視網膜屏障功能的影響，為相關的眼底疾病的防治提供理論依據。

1材料和方法

1.1材料4～6周齡健康SD大鼠80只，體質量80～100g，屈光間質透明，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供；室溫18℃～25℃，空氣流通，相對濕度40%～70%；動物自由攝食飲水，飼料為全價鼠顆粒飼料，由福建醫科大學動物中心提供。實驗過程符合國家科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》。普通熒光燈管(Philips照)，DHG.9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)，可見光分光光度計(Beckman，Fulletton)，CAPHILIPS EM208型透射電鏡、恒冷冰凍切片機(Shanton，英國)，臺式高速冷凍離心機(Beckman Coulter，USA)，光照度計(TES電子)。

1.2方法

1.2.1動物分組及處理大鼠80只隨機分到對照組(40只)和光照組(40只)。光照組再隨機分成4個亞組(每組10只)，按照晝夜節律分別接受1、3、7、14d人工強光照射：用白色熒光燈管(30W)，照射12h(10000lx，6∶00～18∶00)，避光12h。對照組只接受自然光線照射，不接受人工強光照射，按照4個時間點隨機分成4個亞組(每組10只)。箱內溫度控制在22℃～25℃，每3d給予阿托品凝膠點眼1次。于強光照射后1、3、7、14d分別摘取相應時間點光照亞組10只大鼠及對照亞組10只大鼠雙側眼球。每組每個時間點各取2只大鼠，一眼用于病理檢查，另一眼用于超微結構觀察；各取2只用于EB灌注-視網膜鋪片-激光共聚焦檢測；各取6只大鼠用于EB定量檢測視網膜血管通透性檢測。

1.2.2組織病理切片檢測摘取眼球后立即置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中，在解剖顯微鏡下取下后段眼杯，并將眼杯重新置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中，4℃固定24h后取出眼杯，脫水后OCT包埋劑、-20℃冰凍，平行于角膜和視盤做矢狀方向連續切片，厚度8μm，經復水、蘇木素染液染色后進行脫水、透明，用中性樹脂封片,在光學顯微鏡下觀察并攝像。

1.2.3視網膜光損傷超微結構觀察將眼球置于含3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1mol/L PBS(pH=7.2)的固定液內，在解剖顯微鏡下取出眼杯，將眼杯重新置于4℃的3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1mol/L PBS(pH=7.2)溶液中固定24h，然后在解剖顯微鏡下以光滑的圓頭細玻璃棒小心剝離視網膜，在視乳頭處剪斷視網膜與鞏膜粘連，修剪視網膜成寬約1mm的條狀組織；經漂洗、固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、聚合、切片、染色后，做厚度為70～80nm切片，再分別經醋酸鈾染色、檸檬酸鉛染色，最后在PHILIPS EM208型透射電鏡下觀察并攝像。

1.2.4視網膜血管通透性檢查

1.2.4.1激光共聚焦檢測通過鼠尾靜脈注射EB(45mg/kg)，然后麻醉處死大鼠，并迅速取眼球放入4%多聚甲醛固定1h后，取出在手術顯微鏡下進行視網膜鋪片，再以波段為540nm綠色激光激發視網膜中EB染料發紅光，最后照相系統拍攝。

1.2.4.2 EB定量檢測視網膜血管通透性改變通過鼠尾靜脈注射EB(45mg/kg)，然后每隔15min經股動脈抽血0.3mL入抗凝管，離心30min，取上清液檢測血漿中EB濃度。注射EB 2h后經左心室灌注多聚甲醛檸檬酸鹽緩沖液(37℃，pH=3.5)，灌注維持2min，灌注壓為120mmHg；然后在顯微鏡下分離后部視網膜，并放入預先稱重的EP管內；再將EP管放入60℃快速真空干燥器中5h，最后稱重。計算視網膜干重后，加入120μL甲酰胺，離心30min，去除視網膜碎片后取上清液100μL，采用雙波可見光分光光度計檢測EB濃度(EB吸收峰620nm，吸收谷740nm，OD=OD620nm-OD740nm)，通過標準曲線計算上清液中EB濃度。視網膜中EB的濃度通過下列公式計算：

EB吸收峰和吸收谷測定：采用濃度為2000μg/L的EB標準液進行波長掃描，檢測EB的吸收峰和吸收谷。

2結果

2.1組織病理學結果光鏡觀察結果顯示，對照組視網膜形態正常，結構層次清楚，內外節排列整齊規則。光照組在強光照射下1d后開始出現外核層厚度變薄；7d后外核層細胞厚度與內核層相當；14d時外核層細胞大量減少，厚度較內核層明顯變薄(圖1)。

2.2視網膜超微結構觀察結果透射電子顯微鏡檢查結果顯示，對照組大鼠視網膜組織結構層次清楚，細胞形態規整。光照組大鼠視網膜1d后就出現超微結構改變，視網膜光感受器細胞外節膜盤大量脫落，疊狀結構解離，內節線粒體腫脹、空泡變性和嵴消失；3d后，光感受器細胞線粒體腫脹，視網膜內、外節空泡變性明顯增多，部分細胞核開始出現皺縮，核電子密度增強，呈現凋亡的跡象(圖2)。

2.3激光共聚焦結果激光共聚焦顯微鏡視網膜微血管成像顯示，光照組在1d后就出現EB從視網膜血管漏出，第14d滲漏最明顯；而對照組各個時間點上均未發現EB從視網膜血管漏出(圖3)。

2.4 EB視網膜血管通透性檢測結果圖4顯示EB濃度的標準曲線(0～40000μg/L，y=0.00007196x，R2=0.999519，P<0.001)。兩組各時間點的測量結果如圖5所示。采用重復測量數據的方差分析結果：光照組與對照組視網膜EB濃度的差異具有統計學意義(F組間=108.556，P<0.01)；在不同時間點上，光照后1d兩組間視網膜EB濃度的差異有統計學意義(t=5.945，P<0.050)，光照后3d兩組間視網膜EB濃度的差異有統計學意義(t=6.457，P<0.05)，光照后7d兩組間視網膜EB濃度的差異有統計學意義(t=4.272，P<0.05)，光照后14d兩組間視網膜EB濃度的差異有統計學意義(t=6.110，P<0.05)。采用重復測量數據的方差分析結果：各個時間點上光照組視網膜上EB濃度的差異無統計學意義(F時間=1.577，P=0.203)。

圖1視網膜HE染色A：正常對照組；B：光照組7d；C：光照組14d。

圖2視網膜超微結構觀察結果A：正常對照組(×3000)；B：光照1d(×3000)；C：光照3d(×10000)。

圖3激光共聚焦結果A：正常對照組；B：光照組3d；C：光照組14d。

圖4EB濃度的標準曲線。

圖5定量檢測不同時間點對照組、光照組視網膜EB的濃度。

3討論

血-視網膜屏障是由內屏障和外屏障組成。內屏障由視網膜血管內皮細胞及其粘連小帶和閉鎖小帶構成，具有嚴格的選擇通透性及單向主動轉運作用[1]。外屏障由視網膜色素上皮細胞及其緊密連接組成，具有選擇通透性，同時可主動轉運各種離子、分子和液體[2]。正常情況下血-視網膜屏障內向通透性明顯低于外向通透性，這與視網膜血管內皮細胞的單向主動轉運作用及視網膜色素上皮細胞上皮泵作用有關，細胞間緊密連接和轉運功能的正常是維持神經視網膜內環境穩定的必要條件[3]；任何損傷累及視網膜血管內皮細胞和視網膜色素上皮細胞皆可引起血-視網膜屏障破壞。目前研究表明,視網膜經強光長時間的照射后易引起光感受器層的光損傷，啟動了細胞凋亡，光感受器細胞進行性凋亡，外節膜盤不斷脫落，視網膜色素上皮細胞不斷吞噬，在超出其負荷時即出現了視網膜色素細胞的凋亡，繼而引起血視網膜內、外屏障均破壞[4-5]。本實驗觀察到強光照射1d視網膜光感受器細胞外節膜盤不斷脫落，光感受器細胞變性，視網膜外核層厚度變薄；隨著強光照射時間延長，視網膜外核層進行性變薄，并逐漸出現視網膜外節膜盤完全丟失、光感受器細胞凋亡。在相應的時間點采用Evans藍定量檢測和激光共聚焦顯微鏡觀察血管滲漏情況的方法，對血-視網膜屏障功能進行了定量和定性檢測。實驗結果顯示視網膜在強光照射1d后就出現EB從視網膜血管漏出，在激光共聚焦顯微鏡下可清楚觀察到14d時EB從血管滲漏情況比3d明顯；通過定量檢測視網膜上EB濃度方法，并進一步統計分析，卻得出不同時間點上視網膜EB濃度差異無統計學意義。這似乎有矛盾，我們將從以下三個方面進一步分析：第一從實驗方法上分析，顯微鏡下觀察只是觀察到視網膜某一局部EB滲漏情況，具有局限性，而對視網膜上EB濃度的定量檢測可克服此局限性；第二從統計方法上分析：由于我們樣本量較少，有抽樣誤差可能，最好通過增加樣本量來減少抽樣誤差，以確保結果可靠性；第三從病理生理機制上分析：從上述各種實驗方法都說明，強光刺激早期就能夠損傷視網膜的超微結構并破壞血-視網膜屏障，導致視網膜血管滲透性增加。隨著強光照射持續，視網膜超微結構損傷一直逐漸在加重，并出現細胞變性、凋亡(其中具體機制有待于我們進一步研究)；但血-視網膜屏障破壞程度并沒有顯著增加，甚至在7d時較前還有一定好轉，但統計學分析沒有顯著差異可能與樣本數較少有關，這可能暗示我們強光損傷血-視網膜屏障后，視網膜會自發去修復部分血-視網膜屏障，這個修復機制研究可能會產生重要臨床價值，甚至可能找到相關眼底疾病治療的新方法。當然這種自身修復血-視網膜屏障的能力是有限度，當光損傷因素持續存在，到14d時，視網膜上EB濃度明顯增加，說明血-視網膜屏障損傷程度在加重；如果我們把實驗時間再延長，也許能更全面顯示光損傷時間與血-視網膜屏障損傷程度之間的關系。另一方面也提示我們，如果在血-視網膜屏障損傷早期，及時消除光損傷因素，也許可以終止血-視網膜屏障進一步損傷，并隨著視網膜自身修復機制啟動，血-視網膜屏障損傷可能有不同程度修復，這就為防治不恰當光照損傷視網膜提供策略。

參考文獻

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基金項目：國家自然基金(No.81271026)

作者單位：1(350122)中國福建省福州市，福建中醫藥大學臨床技能教學中心；2(350003)中國福建省福州市，福建醫科大學第一附屬醫院眼科

作者簡介：王小婷，女，碩士，助教，研究方向：視網膜疾病。

通訊作者：徐國興，男，教授，主任醫師，博士研究生導師，研究方向：晶狀體、視網膜病.fjmuxgx@163.com

收稿日期：2016-03-09 修回日期： 2016-07-07

Foundation item:National Natural Science Foundation of China(No.81271026)

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.8.08

?KEYWORDS:retinal injury of light; blood-retina barrier; apoptosis

Effect of light damage on the function of blood-retinal barrier in rats

Xiao-Ting Wang1, Guo-Xing Xu2, Wei Xu2, Mao-Song Xie2

Abstract