醇提與水提工藝消栓通絡(luò)片對(duì)大鼠局灶性腦缺血的治療作用對(duì)比

李卓瓊，宗紹波，周軍，王振中，蕭偉

(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司　中藥制藥過程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港　222001)

?

醇提與水提工藝消栓通絡(luò)片對(duì)大鼠局灶性腦缺血的治療作用對(duì)比

李卓瓊，宗紹波，周軍，王振中，蕭偉

(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司中藥制藥過程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港222001)

摘要：目的對(duì)比研究改工藝后消栓通絡(luò)片與市售消栓通絡(luò)片對(duì)大鼠局灶性腦缺血的治療作用差異。方法采用頸內(nèi)動(dòng)脈插入尼龍線栓的方法建立大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion， MCAO)模型。觀察給藥后各組大鼠行為學(xué)評(píng)分、測(cè)定腦梗死面積及血清超氧化物歧化酶(SOD)、NF-κB、caspase-3含量的差異。結(jié)果改工藝后的消栓通絡(luò)片高、中劑量組均能有效緩解4h，24h時(shí)MCAO引起的行為學(xué)病變，降低行為學(xué)評(píng)分；高、中、低劑量組均能升高M(jìn)CAO引起的SOD降低；高、低劑量組能明顯降低MCAO引起的血清NF-κB的升高；中、低劑量組對(duì)MCAO引起的Caspase-3的顯著升高有一定抑制作用。與市售消栓通絡(luò)片比較，改工藝消栓通絡(luò)片從大鼠行為學(xué)評(píng)分的降低，血清SOD活性的增加，血清Caspase-3、NF-κB的表達(dá)效果均有優(yōu)于市售消栓通絡(luò)片的趨勢(shì)。結(jié)論改工藝消栓通絡(luò)片各劑量組對(duì)腦缺血進(jìn)展期大鼠均有一定的恢復(fù)作用，其藥效略優(yōu)于市售消栓通絡(luò)片。

關(guān)鍵詞：中藥工藝改進(jìn);黃芪;三七;槐花;丹參;缺氧缺血,腦;大鼠

消栓通絡(luò)片是治療中風(fēng)恢復(fù)期的有效驗(yàn)方，有活血化瘀，溫經(jīng)通絡(luò)的作用。臨床常用于腦血栓引起的半身不遂，肢體麻木的治療。我們對(duì)該方的傳統(tǒng)制劑工藝進(jìn)行了改進(jìn)，將黃芪、三七、槐花、丹參四味藥材由原工藝的水提改為60%醇提。制劑改進(jìn)后規(guī)格由原來的1.8 g生藥/片可增加為2.5 g生藥/片，服藥量將明顯減少，增加病患用藥依從性。本實(shí)驗(yàn)采用MCAO法制作大鼠腦缺血再灌注模型對(duì)比觀察改工藝后消栓通絡(luò)片與市售消栓通絡(luò)片對(duì)大鼠局灶性腦缺血的治療作用差異及其作用機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1藥物與試劑

1.1.1供試品改工藝消栓通絡(luò)片浸膏粉由康緣現(xiàn)代中藥研究院提供，規(guī)格：12.27 g生藥/g提取物，批號(hào)130926。

供試品制備方法：將川芎、桂枝、木香、山楂、澤瀉、郁金六味藥材水煎，合并煎液，濾過、濃縮，加乙醇調(diào)至70%，靜置，取上清液濃縮、干燥。黃芪、三七、槐花、丹參四味藥材60%醇提，合并醇提液，濾過。大孔樹脂純化，濃縮，干燥。將兩次所得干浸膏粉碎，加入適量輔料，混勻，加入冰片，混勻，制成顆粒，干燥，壓制成片，包衣，制成2.5g生藥/片的藥物。

1.1.2對(duì)照藥依達(dá)拉奉注射液：20 mL：30 g，2支裝，吉林省輝南長(zhǎng)龍生化藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)2013051002；消栓通絡(luò)片(市售)：1.8 g生藥/片，某公司，批號(hào)：130301。

1.1.3試劑水合氯醛，批號(hào)：20130426；羧甲基纖維素鈉，批號(hào)：20120330；磷酸氫二鈉，批號(hào)：20131125，均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司試劑。氯化鈉，南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：11110421108。2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride(TTC)，sigma公司，Lot#BCBL1305V。核因子κB放免藥盒，批號(hào)：20140401；活化半胱氨酸蛋白酶蛋白3放免試劑盒，批號(hào)：20140410；超氧化物歧化酶檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：20140101，均為北京華英生物技術(shù)研究所試劑。

1.2主要儀器電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；CENTRFUGE5840型冷凍離心機(jī)，Eppendorf；DK-S26恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DHG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雄性，體重280～330g，SPF(Specific Pathogen Free，無特定病原體)級(jí)，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)碼：SCXK(滬)2013-0016。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組取體重280～330 g的雄性大鼠，隨機(jī)分為7組。分組如下：假手術(shù)組(等容積5‰CMC-Na)、模型組(等容積5‰CMC-Na)、陽性藥依達(dá)拉奉組(1.13 mg·kg-1大鼠)、市售消栓通絡(luò)片組(2.7 g生藥·kg-1大鼠)、消栓通絡(luò)片高劑量組(0.44 g提取物·kg-1大鼠)、消栓通絡(luò)片中劑量組(0.22 g提取物·kg-1大鼠)、消栓通絡(luò)片低劑量組(0.11 g提取物·kg-1大鼠)

陽性藥腹腔注射給藥，1.13 mg·kg-1大鼠，其它各給藥組大鼠于術(shù)前0.5 h灌胃給藥1次，10 mL·kg-1大鼠。1次/d，連續(xù)3日，假手術(shù)組、模型組給予等容積5‰CMC-Na溶液。

2.2造模方法采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法復(fù)制左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型。參照文獻(xiàn)方法加以改進(jìn)[1]，分離出頸總動(dòng)脈(Common Carotid Artery ，CCA)，繼續(xù)向下分離并結(jié)扎頸外動(dòng)脈(External Carotid Artery，ECA)，分離出頸內(nèi)動(dòng)脈(Internal Carotid Artery,ICA)，在ECA距ICA 2 mm處剪一小口，將一尼龍栓子插入ECA 并進(jìn)入CCA，輕扎備線，防止出血。剪斷ECA，松開ICA的動(dòng)脈夾，牽引ECA，使其進(jìn)入ICA，繼續(xù)向下推進(jìn)直至尼龍線插入深度約為18 mm停止。此時(shí)松開CCA動(dòng)脈夾，扎緊備線，外留1 cm長(zhǎng)線頭，縫合皮膚，回籠飼養(yǎng)。

于缺血2 h后再灌注，再灌注時(shí)輕拉尼龍線，使尼龍線拔出ICA，進(jìn)入ECA殘端，血流再通，修剪尼龍線栓尾部，回籠自然喂養(yǎng)。

2.3評(píng)價(jià)指標(biāo)

2.3.1對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)的影響[1]見表1。

表1　大鼠行為缺陷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

注：等級(jí)分?jǐn)?shù)越高，表明動(dòng)物的行為缺陷越嚴(yán)重。

2.3.2對(duì)缺血梗死面積的影響[2]TTC染色：大鼠于造模后72 h取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，置-20℃冰箱冰凍20 min，沿冠狀面切成5片，每片約2 mm，置5 mL含有1%TTC的磷酸緩沖溶液中避光溫孵10 min染色，4～5 min翻動(dòng)一次。經(jīng)染色后，正常腦組織呈玫瑰紅色，而梗死組織呈白色。用圖象測(cè)量軟件Image pro-Plus分析腦片面積，分別計(jì)算出5個(gè)腦片共10個(gè)面的總面積和梗死區(qū)域的面積，求出梗死區(qū)面積占總面積的百分比，即梗死率。

2.3.3對(duì)血清超氧化物歧化酶(SOD)、NF-κB、caspase-3含量的影響造模后72 h，于最后一次給藥后0.5 h，麻醉大鼠，勁總動(dòng)脈插管取血，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，用生化法檢測(cè)血清SOD活性，用放免法檢測(cè)血清NF-κB、caspase-3含量。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1消栓通絡(luò)片與市售消栓通絡(luò)片對(duì)缺血性腦損傷模型大鼠行為學(xué)評(píng)分及梗塞率的影響腦缺血后4 h，各給藥組行為學(xué)評(píng)分均有降低，與模型組相比，依達(dá)拉奉組、消栓通絡(luò)片高、中劑量組行為學(xué)評(píng)分均下降(P<0.01)。其余各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。24 h，市售消栓通絡(luò)組和消栓通絡(luò)片高中劑量組大鼠行為學(xué)評(píng)分下降明顯，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各給藥組分值也有下降，但與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

造模后72 h，大鼠腦梗死明顯(P<0.01)，除改工藝低劑量組，其余各給藥組大鼠腦梗塞率均有下降，依達(dá)拉奉組下降明顯，與模型組相比差異有顯著性(P<0.01)。結(jié)果見表2。

3.2消栓通絡(luò)片與市售消栓通絡(luò)片對(duì)血清超氧化物歧化酶SOD、NF-κB、caspase-3含量的影響造模后72 h，大鼠血清NF-κB的含量較假手術(shù)組增高(P<0.05)，給予消栓通絡(luò)片高、低劑量后，能明顯降低大鼠血清NF-κB含量(P<0.05)，其余各組血清NF-κB含量與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。大鼠血清caspase-3含量較假手術(shù)組增高(P<0.05)，給予消栓通絡(luò)片中、高劑量后，能明顯降低大鼠血清caspase-3含量(P<0.01)，其余各組血清caspase-3含量與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠血清SOD含量在給予市售消栓通絡(luò)片和消栓通絡(luò)片各劑量組后與模型組比較均有明顯上升(P>0.01)。結(jié)果見表3。

4　討論

消栓通絡(luò)片由川芎、丹參、黃芪、澤瀉、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂十一味中藥組成，君藥川芎、丹參、郁金中含有水溶性酚酸類化合物[3～4]，其中原兒茶醛和咖啡酸具有廣泛的抑菌、抗病毒、擴(kuò)張心腦血管、抗血小板凝集作用，原兒茶醛等有強(qiáng)烈的清除氧自由基作用。還含有人參皂苷Rg1 、 Rb1 、三七皂苷R1 、黃芪甲苷、丹參酮等。脂溶性成分蘆丁[5]屬于黃酮類化合物，有明顯的擴(kuò)張冠脈的作用，還有抗炎、抗菌、抗病毒等作用，可用于治療毛細(xì)血管脆性引起的出血癥等。該方傳統(tǒng)制劑工藝中黃芪、三七、槐花、丹參四味藥材為水提，我們將水提工藝改為用60%醇提。制劑改進(jìn)后每片含藥量明顯增加，服藥量明顯減少，增加病患用藥依從性。

表2　消栓通絡(luò)片與市售消栓通絡(luò)片對(duì)缺血性腦損傷模型大鼠行為學(xué)評(píng)分及腦梗塞率的影響±s,n=10)

注：與空白組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

表3　消栓通絡(luò)片與市售消栓通絡(luò)片對(duì)缺血性腦損傷模型大鼠血清SOD、NF-κB、caspase-3的影響

注：與空白組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.01。

我們根據(jù)文獻(xiàn)的方法加以改進(jìn)，采用MCAO的方法復(fù)制中動(dòng)脈阻塞的腦缺血模型，觀察改工藝后消栓通絡(luò)片與市售消栓通絡(luò)片對(duì)大鼠局灶性腦缺血的治療作用差異及其作用機(jī)制。造模后72 h，我們觀察到大鼠腦梗塞率達(dá)到20.64%±4.5%，且手術(shù)大鼠出現(xiàn)了明顯的神經(jīng)行為學(xué)障礙，和文獻(xiàn)報(bào)道相符[6～7]，說明模型復(fù)制成功。給予依達(dá)拉奉后，在急性期4 h，很好緩解MCAO引起的行為學(xué)病變，降低行為學(xué)評(píng)分。給予消栓通絡(luò)片與市售消栓通絡(luò)片后發(fā)現(xiàn)，市售消栓通絡(luò)片能很好緩解急性期24 h時(shí)MCAO引起的行為學(xué)病變，降低行為學(xué)評(píng)分。消栓通絡(luò)片高、中劑量組能有效緩解4 h、24 h時(shí)MCAO引起的行為學(xué)病變，降低行為學(xué)評(píng)分。

Caspase家族在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用，其中Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中下游最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶，在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后的樞紐作用。消栓通絡(luò)片高、中劑量組能明顯降低MCAO引起的血清Caspase-3的升高，緩解腦缺血進(jìn)展期細(xì)胞凋亡的持續(xù)發(fā)生，從而達(dá)到腦保護(hù)的作用[8～10]。NF-κB是細(xì)胞內(nèi)最重要的活性蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它調(diào)控大量基因的轉(zhuǎn)錄，包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子、黏附因子、凋亡調(diào)控因子、炎癥通路蛋白、細(xì)胞應(yīng)激蛋白等。大量炎性蛋白質(zhì)的表達(dá)對(duì)細(xì)胞損傷和修復(fù)過程至關(guān)重要[11-14]。消栓通絡(luò)片中、低劑量組對(duì)MCAO引起的NF-κB的明顯升高有一定抑制作用，從而緩解MCAO后的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的持續(xù)發(fā)展，達(dá)到腦保護(hù)作用。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，簡(jiǎn)稱SOD)是清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的一種重要抗氧化酶[2,15]，它能降低氧化應(yīng)激對(duì)腦組織產(chǎn)生的損傷。造模后72 h，在給予改工藝消栓通絡(luò)片后SOD均有明顯上升，提示改工藝消栓通絡(luò)片各劑量組均有良好的抑制腦缺血后氧化應(yīng)激的作用。

以上結(jié)果提示，改工藝后消栓通絡(luò)片各劑量組對(duì)腦缺血恢復(fù)期大鼠均有一定的緩解作用。改工藝消栓通絡(luò)片高劑量組在4 h，減輕行為學(xué)評(píng)分的作用有優(yōu)于市售消栓通絡(luò)片的趨勢(shì)，消栓通絡(luò)片高劑量組對(duì)MCAO后大鼠血清Caspase-3、NF-κB的表達(dá)均有一定的抑制作用，效果有優(yōu)于市售消栓通絡(luò)片的趨勢(shì)。其保護(hù)作用的發(fā)揮可能依賴于對(duì)炎癥及神經(jīng)細(xì)胞凋亡的雙重抑制作用。依達(dá)拉奉對(duì)MCAO后72 h大鼠腦梗塞率有明顯的減小，說明其有較好抗腦缺血作用，而對(duì)72 h時(shí)大鼠血清SOD活性、Caspase-3、NF-κB的表達(dá)無明顯影響，推測(cè)其在72 h時(shí)，對(duì)血清這三個(gè)因子影響較小，此時(shí)間點(diǎn)依達(dá)拉奉并不主要通過影響這三個(gè)因子的表達(dá)發(fā)揮抗腦缺血的作用。

參考文獻(xiàn)

[1]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[2]張秀俠.水飛薊賓對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠保護(hù)作用的研究[J].安徽醫(yī)藥，2016，20(3)：445-449.

[3]葉曉萍.消栓通絡(luò)片中水溶性成分的提取及質(zhì)量控制[J].惠州學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，34(3)：27-30.

[4]葉曉萍，駱小偉，吳仲夏，等.消栓通絡(luò)片中主要藥效成分質(zhì)量控制[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，41(4)：89-92.

[5]朱麗萍.反相高效液相色譜法測(cè)定消栓通絡(luò)片中蘆丁含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2009，18(23)：26-27.

[6]陳香紅，張艷.原花青素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷代謝障礙的影響[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2010，22(13)：15-17.

[7]劉永剛，李芳君，謝少玲.白藜蘆醇對(duì)腦缺血再灌注損傷的抗氧化活性及線粒體保護(hù)作用的研究[J].中成藥，2007，29(9)：1274-1277.

[8]詹海濤，李海燕，孟紅旗，等.香港遠(yuǎn)志提取物對(duì)大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能、細(xì)胞凋亡及NOS表達(dá)的影響[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版)，2011，32(2)：205-208.

[9]Cheng EH,Wei MC,Weiler S,et al.BCL-2,BCL-X(L) sequester BH3 domain-only molecules preventing BAX and BAK mediated mitochondrial apoptosis[J].Mol Cell,2001,8(3):705-11.

[10] Shuto M,Seko K,Kuramoto N,et al.Activation of c-Jun N-Terminal kinase cascades is involved in part of neuronal degeneration induced by trimethyltin in cortical neurons of mice[J].J Pharmacol Sci,2009,109(1):60-70.

[11] Cheng EH,Wei MC,Weiler S,et al.Activation of nuclear transcription factor kappa B(NF-kappaB) is essential for dopamine-induced apoptosis in PC 12 cells[J].J Neurochem,2001,77(2):391-398.

[12] Li Y,Lu YT,Chen XP.Roles of NF-κB in central nervous system damage and repair[J].Neuroscience Bulletin,2007,23(5):307-313.

[13] Ryan KM,Ernst MK,Rice NR,et al.Role of NF-kappaB in p53-mediated programmed cell death[J].Letters to Nature,2000,404(6780):892-897.

[14] Ryan KM,Ernst MK,Rice NR,et al.NF-κB and caspases are involved in the hyaluronan and chondroitin-4-sulphate-exerted antioxidant effect in fibroblast cultures exposed to oxidative stress[J].J Appl Toxicol,2008,28(4):509-517.

[15] 李鋒，王瑩瑩，高薇，等.葛根伍用川芎對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能癥狀及腦組織SOD、MDA的影響[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，6(12)：1025-1027.

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺(tái)(2013ZX 09402203 )

通信作者：蕭偉，男，研究員，研究方向：中藥新藥研發(fā)，E-mai：wzhzh-nj@163.net

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.007

(收稿日期：2016-02-13，修回日期：2016-05-08)

A comparison study of the difference in effect between adjusted XiaoShuan TongLuo and marketed XiaoShuan TongLuo Tablets on rats with focal cerebral ischemia

LI Zhuoqiong,ZONG Shaobo,ZHOU Jun,et al

(JiangsuKanionParmaceuticalCo.,Ltd.;StateKeyLaboratoryofNew-techforChineseMedicinePharmaceuticalProcess,Lianyungang,Jiangsu222001,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the difference in effect between adjusted XiaoShuan TongLuo and marketed XiaoShuan TongLuo tablets on rats with focal cerebral ischemia.MethodsRat models with middle cerebral artery occlusion(MCAO) were established.The behavior,infarction size,SOD activity,NF-κB and CASPASE-3 contents were measured.ResultsCompared with the lower dosage group,higher and middle dosage groups of XiaoShuan TongLuo(0.44 and 0.22 g·kg-1) could remarkably decrease the scales of neurological behavior of MCAO rats.All group of XiaoShuan TongLuo could obviously increase the SOD of MCAO rats remarkably，and higher and lower dosage groups of XiaoShuan TongLuo could obviously decrease the NF-κB lever of MCAO rats.Middle and lower dosage groups of XiaoShuan TongLuo could obviously decrease the CASPASE-3 level of MCAO rats.Compared with marketed XiaoShuan TongLuo tablets,adjusted XiaoShuan TongLuo was prior in the decrease of behavior evaluation,increase in SOD,and the expressions of serum Caspase-3 and NF-κB.ConclusionsEach dosage group of adjusted XiaoShuan TongLuo is helpful in the recovery of rats with cerebral ischemia,whose effect is better than marketed XiaoShuan TongLuo tablets.

Key words:TECHNOLOGY IMPROVING (TCD);Astragalus membranaceus;Panax notoginseng;FLOS SOPHORAE;Salvia miltiorrhiza;Hypoxia-Ischemia,Brain;Rats