液相色譜-串聯質譜法測定大鼠血漿中千層紙素的濃度

徐衛峰，費逸明，何丹，尹恒,2

(1.南京中醫藥大學無錫附屬醫院藥物臨床試驗機構，江蘇 無錫　214071；2.南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇 南京　210023)

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液相色譜-串聯質譜法測定大鼠血漿中千層紙素的濃度

徐衛峰1，費逸明1，何丹1，尹恒1,2

(1.南京中醫藥大學無錫附屬醫院藥物臨床試驗機構，江蘇 無錫214071；2.南京中醫藥大學第一臨床醫學院，江蘇 南京210023)

摘要：目的建立快速且靈敏的液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)測定大鼠血漿中千層紙素的濃度。方法色譜分離采用C18色譜柱，甲醇-10 mmol·L-1醋酸銨(77∶23,V/V)為流動相，流速1.05 mL·min-1。大鼠血漿加入β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶，37℃孵化過夜，再加入內標染料木素及0.1%磷酸溶液，用乙酸乙酯提取，上清液40 ℃水浴中氮氣流吹干，以流動相200 μL溶解殘渣，進行分析。檢測器采用四極桿串聯質譜儀，離子源采用電噴霧電離離子源(ESI)，檢測方式采用選擇反應檢測掃描(SRM)，檢測離子：千層紙素[M+H]+ 284.9→269.9，內標[M+H]+ 270.9→270.9。結果千層紙素在5～1 000 μg·L-1范圍內，線性關系良好，回收率大于85%，日內和日間的相對標準偏差(RSD)小于15%。結論建立的LC-MS/MS法符合生物樣品分析的要求，可用于研究大鼠灌胃千層紙素后血漿中千層紙素的測定。

關鍵詞：黃芩；串聯質譜法；千層紙素A；大鼠,Sprague-Dawley

黃芩(拉丁學名：ScutellariabaicalensisGeorgi)，別名山茶根、土金茶根，是唇形科黃芩屬多年生草本植物，根入藥，味苦、性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒、止血等功效,主治溫熱病、上呼吸道感染、肺熱咳嗽、濕熱黃膽、肺炎、癰腫癤瘡等癥。黃芩中的主要黃酮類化合物有黃芩苷(baicalin)、黃芩苷元(baicalein)、漢黃芩素(wogonin)、漢黃芩苷(wogonoside)、千層紙素(oroxylin A)等[1-2]。研究表明,上述黃酮類化合物有較強的藥理活性[3-6]，其中千層紙素具有廣泛的生物活性，兼有抗炎、抗休克、抗腫瘤以及保護心腦血管等功效，是目前國內外研究的一個熱點[4-11]。

由于在體內大多數黃酮類化合物以葡萄糖醛酸結合物的形式存在，要滿足一定的靈敏度來檢測其游離原型藥物濃度存在諸多困難。有報道，通過酶水解的方式來測定原形藥物和結合藥物的總濃度，是可行的[12]。關于藥物中千層紙素的含量測定方法較為成熟，但其血藥濃度的測定有文獻報道采用超高效液相色譜-二極管陣列法(UPLC-DAD)[13-14]，運用LC-MS/MS法卻鮮有報道。本文利用LC-MS/MS法，快速而靈敏地測定了灌胃給藥后大鼠血漿中千層紙素的血藥濃度,并有利于進一步的藥代動力學研究[15]。

1　材料

1.1藥品與試劑千層紙素對照品(上海源葉生物科技有限公司，純度>99.0%，批號：20140512)，染料木素作為內標(上海同田生物有限公司，純度>99.0%，批號：20140311)，β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶(美國Sigma公司，G1512，Type H-5，批號：232-606-8)，甲醇(美國Merck公司，色譜純，批號：I603010 -136)，醋酸銨(國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號：20140603)，實驗用水為超純水(自制)。

1.2儀器及測試條件Finnigan Surveyor LC-TSQ Quantum Ultra AM 液相色譜-三級串聯四極桿質譜(LC-MS/MS)系統(Thermo Finnigan)。

色譜-質譜條件：采用Hanbon Lichrospher C18(250 mm×4.6 mm I.D.,5 μm)色譜柱，甲醇-10 mmol·L-1醋酸銨(77∶23，V/V)為流動相，流速1.05 mL·min-1，柱溫20℃，分流比3∶1。電噴霧離子化，正離子SRM檢測；噴口電壓5 kV，霧化氣壓35 kPa，輔助氣壓5 kPa，毛細管溫度300 ℃，CID碰撞能量-8eV；用于定量的SRM檢測離子為：千層紙素[M+H]+284.9→269.9，染料木素[M+H]+270.9→270.9。見圖1。

1.3實驗動物健康SD大鼠，雌雄各半，體重220～240 g，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物飼養許可證號SYXK(蘇)2013-0008。

2　實驗方法

2.1溶液制備千層紙素工作溶液：精密稱定千層紙素對照品，在量瓶中加甲醇溶解并稀釋，制成千層紙素濃度為1 g·L-1的溶液，再分別用甲醇稀釋成千層紙素濃度為0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10 mg·L-1的系列工作溶液。

內標溶液：精密稱定染料木素，在量瓶中加甲醇溶解并稀釋，制成染料木素濃度為200 mg·L-1的內標溶液。

2.2血漿樣品處理取大鼠血漿(肝素抗凝處理)200 μL置5 mL離心管中，加入β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶(100/4 U·mL-1)50 μL，渦旋混合15 s，經過37℃孵化過夜，然后依次精密加入內標溶液5 μL、0.1%的磷酸100 μL，分別渦旋混合15 s，再加入乙酸乙酯2 mL，渦旋混合3 min，離心5 min(10 000 r·min-1)，分取上清液1.6 mL，置40℃水浴中用氮氣流吹干，以流動相200 μL溶解殘渣，渦旋混合3 min，離心5 min(10 000 r·min-1)，取20 μL進行LC-MS/MS分析。

圖1　千層紙素(A)和染料木素(B)的全掃描質譜圖

(A)大鼠空白血漿；(B)大鼠空白血漿中添加千層紙素和內標(濃度分別達到5 μg·L-1)；(C)大鼠灌胃千層紙素后的血漿。色譜峰：內標(上)，千層紙素(下)。

圖2LC-MS/MS法測定大鼠血漿中千層紙素的典型色譜圖

2.3方法特異性考察取大鼠空白血漿、添加千層紙素和內標的血漿、給藥后血漿樣品各200 μL按“血漿樣品處理”項下方法進行處理，測定結果如圖2。千層紙素和內標的保留時間分別約為5.0 min和3.0 min，內源性物質不干擾千層紙素和內標色譜峰。

2.4標準曲線和定量下線取大鼠空白血漿200 μL，分別加入千層紙素系列工作溶液20 μL，制成千層紙素濃度各為5、10、20、50、100、200、500、1 000 μg·L-1的血漿樣品，按“血漿樣品處理”項下方法操作。通過加權(1/C2)最小二乘法進行線性回歸，橫坐標為千層紙素血漿濃度(μg·L-1)，縱坐標為千層紙素與內標峰面積之比(Ri)。結果顯示，千層紙素血漿樣品標準曲線的回歸方程為Ri=0.0029C+0.0576，r=0.996 6，線性范圍為5～1 000 μg·L-1,定量下限為5 μg·L-1。

2.5回收率試驗取3支潔凈離心管，分別加入濃度為0.1、0.5、2 mg·L-1的千層紙素系列工作溶液20 μL，按“血漿樣品處理”項下方法操作，測得Rs=樣品/內標峰面積比。另取3支潔凈離心管，分別加入大鼠空白血漿200 μL和千層紙素系列工作溶液20 μL，制成千層紙素濃度各為10、50、200 μg·L-1的血漿樣品，按同法操作，測得Ri=樣品/內標峰面積比。平行做5份，按照回收率R(%)=(Ri/Rs)×100%計算，3個不同濃度水平下的千層紙素回收率均大于85%。結果見表1。

表1　大鼠血漿中千層紙素的回收率(n=5)

2.6精密度和準確度另取3支潔凈離心管，分別加入大鼠空白血漿200 μL和千層紙素系列工作溶液20 μL，制成千層紙素濃度各為10、50、200 μg·L-1的血漿樣品，按“血漿樣品處理”項下方法進行測定，平行做5份，考察血漿樣品中測定千層紙素的精密度和準確度，所得結果表明該檢測方法的精密度和準確度均良好。見表2。

2.7基質效應的考察取6只大鼠的空白血漿，不加內標，按“血漿樣品處理”項下操作，揮干后加適量千層紙素工作溶液，加流動相200 μL溶解殘渣，制成濃度為10、50、200 μg·L-1的溶液，每個濃度進樣5次，得到峰面積B；再用相同比例溶劑配制成濃度為10、50、200 μg·L-1的千層紙素溶液后進樣，得到峰面積為A。待測物的基質效應(%)=B/A×100%，內標亦按上法考察。計算B/A均在85%～115%范圍內，表明基質效應對本法無干擾。

2.8血漿樣品穩定性考察不同條件下千層紙素濃度各為10、50、200 μg·L-1的血漿樣品的穩定性。結果顯示，千層紙素血漿樣品在室溫(18℃)條件下保存12 h的濃度降低小于5%，在冷凍(-20℃)條件下放置2周無明顯損失并且經3次反復凍融后測定千層紙素穩定性良好。

2.9動物實驗分組及過程取SD大鼠6只，雌雄各半，實驗前10 h禁食但可飲水，按40 mg·kg-1劑量灌胃給藥。于給藥前0 min及給藥后10、40 min，1.5、3、5、8、12、24、30、36、48、54、60 h由眼眶后靜脈叢取血約0.4 mL，在肝素化離心管中離心獲取血漿樣品，于-20 ℃條件下保存待分析。

3　結果

3.1方法學評價本實驗采用LC-MS/MS對血漿中千層紙素濃度進行測定。血漿中內源性雜質無干擾，回收率>85%，日內、日間變異系數<15%，定量下限為5 μg·L-1，標準曲線的相關系數r>0.99，質控樣本和凍融試驗均符合標準。

3.2血藥濃度-時間曲線和藥代動力學參數按血漿樣品測定方法對樣品進行處理與測定，依照標準曲線計算濃度，所得血藥濃度-時間曲線如圖3，藥代動力學參數見表3。結果顯示，大鼠灌胃給藥千層紙素后，24 h后達到最大血藥濃度，且最大血藥濃度為105.93 μg·L-1，消除半衰期約為6.6 h。

4　討論

本實驗采用LC-MS/MS法測定大鼠灌胃后血漿中千層紙素的血藥濃度。血漿樣品經有機溶劑提取上清液，在氮氣流下吹干，以流動相溶解殘渣的處理方法，可以提高待測樣品的穩定性和檢測靈敏度，大大縮短檢測時間，同時消除了內源性雜質的干擾。實驗結果表明本法線性、回收率、精密度和準確度均良好，且無基質效應的影響。

表2　大鼠血漿中千層紙素的精密度和準確度(n=5)

圖3　大鼠按40.0 mg·kg-1灌胃千層紙素后千層紙素 平均血藥濃度-時間曲線圖表3　大鼠按40.0 mg·kg-1灌胃千層紙素后血漿中 千層紙素的藥代動力學參數

參數測定值 Vc/Fmg/μg·L-1 0.152019 Cmax/μg·L-1 105.9284 Tmax/h 24 t1/2/h 6.603148 AUCt/h·μg-1·L-1 2992.567 AUCi/h·μg-1·L-1 3019.155 MRT/h 19.91949

本研究的候選內標包括雌二醇、氫化可的松、燈盞乙素、異鼠李素和染料木素，其中結構與千層紙素較相似的有雌二醇和染料木素。而在相同液相條件下，雌二醇與千層紙素的保留時間相似，峰重疊，故染料木素為最佳內標[16]。

本實驗對灌胃給藥后大鼠血漿中千層紙素濃度進行測定，結果顯示SD大鼠口服千層紙素后，在血中迅速地轉化為葡萄糖醛酸結合物或硫酸結合物，測得的千層紙素游離藥物濃度基本低于定量下限?？紤]無法獲得千層紙素葡萄糖醛酸結合物或硫酸結合物的對照品，故加入β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶在37℃下孵化過夜后，使結合物水解為游離原型藥物，測得的千層紙素原型藥物濃度在線性范圍之內[17]。千層紙素血藥濃度的測定區別于黃芩類其他組分的測定[18-19]，分別同時測定千層紙素的游離藥物濃度和結合藥物濃度相對困難。與文獻報道一致[20]，本實驗采用了β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶水解法來處理大鼠血漿樣品，成功地采用LC-MS/MS法測定了大鼠血漿中千層紙素的血藥濃度，對人體千層紙素藥代動力學的研究有一定參考價值。

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通信作者：尹恒，男，博士，副主任中醫師，研究方向：中醫藥臨床和藥物研究，郵箱：yh_go@126.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.010

(收稿日期：2016-02-18，修回日期：2016-05-07)

Determination of oroxylin A in rat plasma by LC-MS/MS

XU Weifeng,FEI Yiming,HE Dan,et al

(DrugClinicalTrialInstitution,WuxiHospitalAffiliatedtoNanjingUniversityofChineseMedicine,

Wuxi,Jiangsu214071,China)

Abstract:ObjectiveTo develop a rapid and sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)method for determination of oroxylin A in rat plasma.MethodsChromatographic separation was achieved on a C18column and the mobile phase consisted of methanol and 10 mmol·L-1ammonium acetate buffer(77∶23,V/V) pumped at a flow rate of 1.05 mL·min-1.The rat plasma samples by enzymatic hydrolysis using β-glucuronidase/sulfatase under 37 ℃ for the night were partitioned with ethyl acetate and centrifuged for sample clean-up after genistin used as internal standard(I.S.) and 0.1% phosphoric acid were added.The supernatant was then evaporated to dryness,and the residue was dissolved in 200 μL of mobile phase and analyzed.The quadrupole tandem mass spectrometer with electrospray ionization ion source(ESI) was performed in the selected reaction monitoring(SRM) mode and the transitions selected for quantitation were [M+H]+ 284.9→269.9 for oroxylin A and [M+H]+ 270.9→270.9 for genistin(I.S.),respectively.ResultsA linear calibration curve for assay of oroxylin A in rat plasma was obtained in the range of 5～1 000 μg·L-1with the recoveries of at least 85% and intra-day and inter-day RSD of 15%.ConclusionThe method can be used for thedetermination of oroxylin A in rat plasma after intragastric administration.

Key words:Scutellaria baicalensis；Tandem Mass Spectrometry;Oroxylin A；Rats,Sprague-Dawley