高效液相色譜法測定復方氯甲霜中氯霉素及甲硝唑的含量

楊瑾，莫國棟，林麗，曾維國，李嘉良，盧志軍

(廣東省中山市第二人民醫院，廣東 中山　528447)

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高效液相色譜法測定復方氯甲霜中氯霉素及甲硝唑的含量

楊瑾，莫國棟，林麗，曾維國，李嘉良，盧志軍

(廣東省中山市第二人民醫院，廣東 中山528447)

摘要：目的對復方氯甲霜的質量標準進行再提高研究。方法色譜柱為AgiLent XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流速為1 mL·min-1；柱溫為30℃；進樣量為10 μL；氯霉素的流動相為甲醇-庚烷磺酸鈉緩沖溶液(32∶68)；紫外檢測波長為277 nm；甲硝唑的流動相為甲醇-水(20∶80)；紫外檢測波長為320 nm。結果氯霉素、甲硝唑進樣量分別在5.56～111.2，26.02～260.2 mg·L-1濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系，r分別為1.000 0和0.999 6(n=6)；平均回收率分別為103.8%，99.6 %，RSD分別為1.73 %和0.43%(n=9)。結論該方法簡便快速、準確、重復性好，可用于該制劑中氯霉素及甲硝唑的含量測定。

關鍵詞:色譜法,高壓液相；氯霉素；甲硝唑

復方氯甲霜是我院皮膚科臨床應用多年的自制制劑，該制劑由氯霉素、甲硝唑等組成，具有抗菌、消炎、殺螨、止癢、收斂等作用，用于治療無滲出性皮炎、酒糟鼻、痤瘡及螨蟲引起的皮膚感染[1-6]。原質量標準僅對氯霉素、甲硝唑做了簡單的化學鑒別，并無含量測定項。為進一步有效控制此制劑的質量，提高其標準，本試驗參文獻[7-10]方法，擬建立了以HPLC 法測定處方中主要成分氯霉素及甲硝唑的含量。結果表明，此方法簡便、準確，可作為控制此制劑的質量指標。

1　材料

1.1儀器、試劑安捷倫1260 液相色譜儀， G1311C泵，G1329B自動進樣器，G1314B紫外檢測器，Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，(Agilent)AT-330色譜柱恒溫箱(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)，AUW220D電子天平(SHIMADZU),TDL-60B離心機(上海安亭科學儀器廠)，AS20500A超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)，甲醇為色譜純，庚烷磺酸鈉為分析純，水為超純水。

1.2試藥氯霉素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：130555-200602)，甲硝唑對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100191-200606)，復方氯甲霜(中山市第二人民醫院自制，批號：20140120、20140121、20140122)。

2　方法與結果

2.1氯霉素

2.1.1溶液的制備(1)供試品溶液：稱取本品0.3 g，加流動相溶解，并轉移至50 mL量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，吸取10 mL渾濁液，離心(轉速3 000 r·min-1，5 min)，取出，吸取上清液，作為供試品溶液。(2)陰性對照溶液：按處方制備不含氯霉素的陰性對照制劑，精密量取陰性對照制劑，按供試品溶液制備項下方法制備，即得。(3)對照品溶液取氯霉素對照品10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。

2.1.2色譜條件色譜柱：AgiLent XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相以甲醇-庚烷磺酸鈉緩沖溶液(32∶68)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30℃；檢測波長為277 nm。取“2.1.1”項下對照品、供試品、陰性對照溶液進樣測定，記錄色譜圖。在此色譜條件下，供試品中其他成分對氯霉素的測定無干擾，見圖1。

注：1為雜質峰，2為氯霉素峰；A為供試品，B為氯霉素對照品，C為陰性對照品。

圖1氯霉素HPLC色譜圖(277 nm)

2.1.3線性相關性試驗精密量取“2.1.1(3)”氯霉素對照品貯備液1，2，2.5，5，10 mL分置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為系列標準溶液，按上述色譜法，分別進樣10 μL，記錄色譜圖。以標準溶液的濃度X(g·L-1)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，氯霉素的回歸方程為：Y=14.637X+0.000 2，(r=1.000 0)。結果表明：氯霉素在5.56～111.2 mg· L-1濃度范圍內，與峰面積呈良好的線性關系。

2.1.4精密度試驗取“2.1.1(3)”項下氯霉素對照品溶液，按上述色譜法，連續測定6次，記錄色譜圖。結果測得氯霉素峰面積RSD為1.08 %，表明采用上述色譜法測定本品含量精密度較高，可滿足本品含量測定要求。

2.1.5重復性試驗取供試品溶液(批號：20140120)，按“2.1.1(1)”供試品溶液制備項下方法制備供試品，連續測定6次，按上述色譜條件測定，結果氯霉素RSD為0.18%，表明表明采用上述色譜法測定本品含量方法重復性良好，可滿足本品含量測定要求。

2.1.6溶液穩定性試驗取供試品溶液(批號：20140120)，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、12、24 h進行測定，記錄色譜圖。結果測得氯霉素RSD為1.26%，表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.1.7回收率試驗精密稱取不含氯霉素的陰性樣品9份，取已知含量的氯霉素對照品，按80%，100%，120%三個水平各配3份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，并計算回收率。結果平均回收率為103.8%，RSD為1.73%(n=9)。

2.1.8含量測定取本品3批，按“2.2.1(1)”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖，按外標法計算含量，結果氯霉素標示百分含量分別為88.15%、87.66%、84.78%，符合標準要求(氯霉素含量應為標示量80.0%～110.0%)。

2.2甲硝唑

2.2.1溶液的制備(1)供試品溶液:稱取本品2.5 g，加流動相溶解，并轉移至100 mL量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，吸取10 mL渾濁液，離心(轉速3 000 r·min-1，5 min)，取出，吸取上清液，作為供試品溶液。(2)陰性對照溶液按處方制備不含甲硝唑的陰性對照制劑，精密量取陰性對照制劑，按供試品溶液制備項下方法制備，即得。(3)對照品溶液取甲硝唑對照品10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。

2.2.2色譜條件色譜柱：AgiLent XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相以甲醇-水(20∶80)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30℃；檢測波長為320 nm。取“2.2.1”項下對照品、供試品、陰性對照溶液進樣測定，記錄色譜圖。在此色譜條件下，供試品中其他成分對甲硝唑的測定無干擾，見圖2。

注：3為甲硝唑峰；D為供試品，E為甲硝唑對照品，F為陰性對照品。

圖2甲硝唑HPLC色譜圖

2.2.3線性相關性試驗精密量取“2.2.1(3)”甲硝唑對照品貯備液1，2，2.5，5 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為系列標準溶液，按上述色譜法，分別進樣10 μL，記錄色譜圖。以標準溶液的濃度X( g·L-1)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，甲硝唑的回歸方程為：Y=32.517X-55.993，(r=0.999 6)。結果表明：甲硝唑在26.02～260.2 mg·L-1濃度范圍內，與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.4精密度試驗取“2.2.1(3)”項下甲硝唑對照品溶液，按上述色譜法，連續測定6次，記錄色譜圖。結果測得甲硝唑峰面積RSD為0.54%，表明采用上述色譜法測定本品含量精密度較高，可滿足本品含量測定要求。

2.2.5重復性試驗取供試品溶液(批號：20140120)，按“2.1.1(1)”供試品溶液制備項下方法制備供試品，連續測定6次，按上述色譜條件測定，結果甲硝唑RSD為0.78%，表明表明采用上述色譜法測定本品含量方法重復性良好，可滿足本品含量測定要求。

2.2.6溶液穩定性試驗取供試品溶液(批號：20140120)，按上述色譜條件分別于0、2、4、6、12、24 h進行測定，記錄色譜圖。結果測得甲硝唑RSD為1.47%，表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.2.7回收率試驗精密稱取不含甲硝唑的陰性樣品9份，取已知含量的甲硝唑對照品，按80%、100%、120%三個水平各配三份，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定，并計算回收率。結果平均回收率為99.6 %，RSD為0.43%(n=9)。

2.2.8含量測定取本品3批，按“2.2.1(1)”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖，按外標法計算含量，結果甲硝唑標示百分含量分別為87.72 %、87.67 %、87.44%，符合標準要求(甲硝唑含量應為標示量80.0 % ～ 110.0 %)。

3　討論

取甲硝唑和氯霉素對照品，分別加甲醇適量使溶解并稀釋成每1 mL 中含10 μg 的溶液，照紫外-可見分光光度法在200 ～400 nm 波長范圍內進行掃描，結果表明，甲硝唑在320 nm 波長處有最大吸收，氯霉素在277 nm 波長處有最大吸收。有文獻選擇278 nm作為檢測波長，同時檢測這兩種物質，雖然方法簡單，但是由于同一流動相及波長下，氯霉素和甲硝唑的響應值差別較大，峰形差，保留時間長，分析準確度有所降低。為使氯霉素和甲硝唑有較好的響應，所以本文分別采用不同流動相不同波長下測定氯霉素及甲硝唑的含量。

參考文獻

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doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.07.014

(收稿日期：2016-02-28，修回日期：2016-04-17)

Quality specification standard of Chloramphenicol Metronidazole Cream

YANG Jin,MO Guodong,Lin Li，et al

(SecondPeople’sHospital,Zhongshan,Guangdong528447,China)

Abstract:ObjectiveTo improve quality standards of Chloramphenicol Metronidazole Cream.MethodsChloramphenicol andmetronidazole were assayed by HPLC.AgiLent XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm) was used at the rate of 1.0 mL·min-1.The injection volume was 10 μL and the column temperature was set at 30 ℃.277 nm and 320 nm were selected asthe detection wavelengths forchloramphenicol and metronidazole respectively,and themobile phasesweremethanol-sodiumheptanesulfonate(32∶68)forchloramphenicol and methanol-water(20∶80)formetronidazole,respectively.ResultsA good linearrelationship was established between the peak response and the concentration of chloramphenicol and metronidazole over the range of 5.56～111.2 mg·L-1(r=1.000 0) and 26.02～260.2 mg·L-1(r=0.999 6) respectively.The mean recoveries of chloramphenicol and metronidazole were103.8 %(RSD=1.73%)and 99.6 %(RSD=0.43%),respectively．ConclusionThe method is simple,accurate and repeatable,which can be used for the determination of Chloramphenicol Metronidazole Cream.

Key words：Chromatography,High Pressure Liquid；Chloramphenicol；Metronidazole