PHBHHx與人臍帶間充質干細胞的體內異位成骨研究*

馬敏先，何志旭，王　梅，葉　川,王　永，曾　筱，張俊標，劉　琴

(1.貴州醫科大學附屬醫院口腔修復科，貴陽 550004；2.貴州醫科大學干細胞與組織工程中心，貴陽 550004;3.貴州省貴陽市口腔醫院口腔修復科　550002；4.貴州醫科大學附屬醫院骨科，貴陽 550004)

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PHBHHx與人臍帶間充質干細胞的體內異位成骨研究*

馬敏先1，何志旭2，王梅3，葉川4,王永1，曾筱1，張俊標1，劉琴1

(1.貴州醫科大學附屬醫院口腔修復科，貴陽 550004；2.貴州醫科大學干細胞與組織工程中心，貴陽 550004;3.貴州省貴陽市口腔醫院口腔修復科550002；4.貴州醫科大學附屬醫院骨科，貴陽 550004)

目的探討以3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯(PHBHHx)為支架材料，以人臍帶間充質干細胞(hUCMSCs)為種子細胞的復合物體內構建組織工程骨的能力。方法將hUCMSCs接種在PHBHHx上體外成骨誘導培養2周，誘導組為實驗組，不滴加hUCMSCs組為對照組，植入裸鼠皮下，并分別于1、3、5個月取材行HE、Ⅰ型膠原免疫組織化學、堿性磷酸酶染色及逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測。結果PHBHHx表現出良好的細胞吸附性。實驗組細胞大、小形態基本保持原狀，成骨特異性指標檢測均為陽性；對照組細胞則不能保持原狀，體積逐漸縮小至完全降解，成骨特異性指標均為陰性。結論PHBHHx復合hUCMSCs經體外成骨誘導后具有在裸鼠體內異位構建組織工程骨的能力。

間充質干細胞；組織工程；骨；3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯

近年來，種植義齒已成為牙列缺損或缺失患者主流的修復方法。目前采用的引導骨再生技術、上頜竇提升術等只能修復少量的牙槽骨缺損；自體骨移植雖然安全可靠，無免疫排斥，但將造成供區繼發損傷和并發癥；異體或異種骨移植能修復較大骨缺損，但存在免疫排斥。如今骨組織工程已被認為是修復大段骨缺損最有希望的方法之一[1]，支架材料與種子細胞是其中最重要的兩個因素。人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)含量豐富，具有低免疫原性，取材及分離培養過程對供者無損害，不涉及社會倫理等方面的爭議，在組織工程領域具有廣闊的應用前景[2-3]。3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate,PHBHHx)因具有較佳的力學性能、良好的生物相容性和可完全降解性，在組織工程和醫用材料領域備受關注[4-6]。目前，PHBHHx在組織工程軟骨、血管、心臟瓣膜等領域研究較多[7]，但在骨組織工程研究領域中國內、外報道甚少。本實驗以hUCMSCs為種子細胞，以PHBHHx為支架材料，對hUCMSCs和PHBHHx作為骨組織工程種子細胞和可吸收載體材料應用的可行性進行研究。

1　材料與方法

1.1實驗動物裸鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，SPF級，4～5周齡，16～18 g，許可證號：SCXK(京)2009-0007。

1.2儀器與試劑Thermo 3131型CO2培養箱(Thermo公司，中國)，Nikon TE-2000型倒置相差顯微鏡(Nikon公司，日本)，2331型PCR擴增儀(Eppendorf公司，德國)，BYY-BC型電泳儀(北京六一儀器廠)；DMEM培養基(Gibco公司 ，美國)，胎牛血清(杭州四季青)，堿性磷酸酶染色試劑盒(南京建成生物有限公司)，Ⅰ型膠原免疫組織化學染色試劑盒(武漢博士德生物有限公司)。

1.3臍帶及支架材料來源臍帶從貴州醫科大學附屬醫院產科獲得，均來自足月妊娠剖宮產健康胎兒。經產婦及家屬同意，臍帶標本用于科學實驗研究。PHBHHx由清華大學化工系研制并提供，孔徑為100～200 μm，孔隙率90%，孔間相互連通。

1.4實驗方法

1.4.1hUCMSCs體外分離培養及鑒定無菌收集臍帶，剝離華通膠，將其剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，均勻接種于含完全培養基(低糖DMEM培養基和10%胎牛血清)的培養瓶內，置37℃、5%CO2飽和濕度培養箱內培養，倒置顯微鏡觀察細胞的生長和形態變化；當細胞生長融合達90%時，按1∶2的比例傳代。

1.4.2hUCMSCs向成骨細胞誘導分化及鑒定收集第4代hUCMSCs，將細胞以1×105/mL的密度接種于6孔板，用完全培養基進行培養，次日實驗組更換成誘導培養基(含10%胎牛血清、1×10-8mol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的高糖DMEM培養基)進行成骨細胞誘導，對照組用完全培養基進行培養，每3天更換1次培養液，誘導14 d后進行Ⅰ型膠原免疫組織化學和堿性磷酸酶染色(alkaline phosphatase,ALP)染色，21 d后進行茜素紅染色。

1.4.3hUCMSCs/PHBHHx復合物的構建并植入裸鼠皮下將PHBHHx切成1.00 cm×0.50 cm×0.05 cm大小，高溫高壓消毒，利用完全培養基浸泡備用。收集第4代hUCMSCs，按 2×107/mL的密度將細胞懸液滴加在PHBHHx上，2 d后更換培養基，實驗組更換為成骨誘導液,對照組則是未滴加細胞成分的PHBHHx。 hUCMSCs/PHBHHx體外復合培養2周，用10%水合氯醛作裸鼠腹腔注射麻醉(5 mL/kg)，消毒皮膚，在背部正中切開長約1 cm，血管鉗鈍性分離后左側和右側皮下分別植入實驗組和對照組細胞/材料復合物，實驗組和對照組各植入12塊復合物。術后裸鼠單只分籠飼養，觀察裸鼠整體和切口愈合情況及復合物形態變化。

1.4.4檢測指標于植入后第1、3、5個月分別予戊巴比妥安樂死處理4只裸鼠，石蠟包埋，組織切片行HE、Ⅰ型膠原免疫組織化學、ALP染色。逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測第3、5個月實驗組和對照組的骨特異性Ⅰ型膠原和骨橋蛋白mRNA的表達情況。引物由上海生工生物工程有限公司合成，擴增產物的大小及引物序列分別如下：β-actin的擴增產物大小為564 bp，上游引物5′-CTG GGA CGA CAT AGG AGA AAA-3′，下游引物5′-AAG GAA GGC TGG AAG AGT GC-3′；Ⅰ型膠原蛋白擴增產物大小為371 bp，上游引物5′-GGC AAG GTG TTG TGC GAT GAC-3′，下游引物5′-AGA CCA CGA GGA CCA GAG GGA C-3′；骨橋蛋白擴增產物大小為280 bp，上游引物5′- TGC TGG TGT AGA CCC CAA AAG-3′，下游引物5′- CAG GGA GTT TCC ATG AAG CCA C-3′。

2　結　　果

2.1hUCMSCs形態學觀察及鑒定原代培養6 d左右組織塊周圍有細胞爬出，貼壁生長，12 d左右細胞生長增快、數量增多，呈平行排列或漩渦狀生長，傳至第4代以后，細胞形態較單一，多為長梭形。

A：成骨細胞Ⅰ型膠原免疫組織化學染色(×100)；B：成骨細胞堿性磷酸酶染色(×100)；C：成骨細胞茜素紅染色(×100)。

圖1hUCMSCs成骨分化及鑒定

A～C：hUCMSCs/PHBHHx植入裸鼠背部皮下1(A)、3(B)、5(C)個月大體觀；D～F：hUCMSCs/PHBHHx實驗組植入1(D)、3(E)、5(F)個月大體觀；G～H：hUCMSCs/PHBHHx對照組植入1(G)、3(H)個月大體觀。

圖2hUCMSCs/PHBHHx復合物植入裸鼠大體觀

A～C：hUCMSCs/PHBHHx實驗組植入1(A)、3(B)個月HE染色(×100),5(C)個月HE染色(×300)；D～E：PHBHHx對照組植入1(D)、3(E)個月HE染色(×100)。

圖3hUCMSCs/PHBHHx復合物HE染色

A:1個月；B：3個月；C：5個月。

圖4hUCMSCs/PHBHHx實驗組植入1、3、5個月Ⅰ型膠原免疫組織化學染色(×100)

2.2hUCMSCs成骨分化及鑒定成骨誘導14 d，Ⅰ型膠原免疫組織化學染色呈陽性，細胞膜及細胞外基質呈棕黃色，提示局部有Ⅰ型膠原合成和分泌(圖1A)，對照組染色呈陰性；堿性磷酸酶染色呈陽性，胞質中呈現灰黑色顆粒或條狀、塊狀沉淀(圖1B)，對照組染色呈陰性；成骨誘導21 d，茜素紅染色呈陽性，細胞匯合聚集后呈多層重疊生長，圓形的礦化結節呈紅色，周圍折光性增強(圖1C)，對照組細胞無礦化結節形成，染色呈陰性。

2.3hUCMSCs/PHBHHx復合物植入裸鼠大體觀實驗組細胞/支架復合物的大小形態于1、3、5個月基本保持原狀，質地變硬；而對照組細胞/支架復合物則不能保持原狀，體積逐漸縮小至完全降解(圖2A、2B、2C)。 實驗組1個月時取材見大部分區域仍呈灰白色，表面形成纖維包裹，略光滑，質韌；3個月時表面微紅，質地稍硬，仍有少量材料殘留；5個月時復合物被硬組織替換，色紅，厚度增加，硬度增大，新生血管相互融合(圖2D、2E、2F)。對照組1個月時取材見植入物體積縮小，表面呈灰白色，未見纖維包裹；3個月時體積明顯縮小，大多降解，僅殘留少許碎塊，色澤略深；5個月時完全降解，僅見少許黏液樣物質(圖2G、2H)。

2.4HE染色實驗組1個月時細胞沿PHBHHx孔壁生長，骨組織雛形形成，骨小梁、骨髓腔組織結構清楚，骨小梁周邊成骨細胞被覆并產生骨基質，骨基質內見骨細胞及小血管增生，部分材料降解；3個月時較多編織骨組織和少量板層骨組織形成，組織結構清楚，板層骨內見哈佛斯系統雛形，仍有少量材料殘留；5個月時較多板層骨組織形成，結構清楚，板層骨內見較多哈弗斯系統樣結構形成，大量骨小梁形成，其內見較多骨細胞，表面被覆生長活躍的成骨細胞，材料完全降解(圖3A、3B、3C)。對照組1個月時PHBHHx表面有大量的空泡和較多的炎性細胞，見明顯PHBHHx殘留；3個月時PHBHHx表面有少量的空泡和炎性細胞，無明顯PHBHHx殘留(圖3D、3E)。

2.5Ⅰ型膠原免疫組織化學染色實驗組1個月時呈微弱陽性(圖4A)，3個月時呈陽性(圖4B)，5個月時呈強陽性，細胞外基質有大量的棕黃色異染區(圖4C)；對照組染色陰性。

2.6堿性磷酸酶染色實驗組1個月時呈微弱陽性(圖5A)，3個月時呈陽性(圖5B)，5個月時呈強陽性，呈藍紫色表達(圖5C)；對照組染色陰性。

2.7RT-PCR檢測實驗組3個月時Ⅰ型膠原蛋白mRNA在371 bp條帶表達，骨橋蛋白mRNA呈陰性表達；對照組均呈陰性表達(圖6A、6B)。5個月時Ⅰ型膠原蛋白mRNA在371 bp條帶表達，骨橋蛋白mRNA在280 bp條帶表達；對照組均呈陰性表達(圖6C、6D)。

A:1個月；B：3個月；C：5個月。

圖5hUCMSCs/PHBHHx實驗組植入1、3、5個月堿性磷酸酶染色(×100)

A～B：hUCMSCs/PHBHHx植入3個月Ⅰ型膠原、骨橋蛋白的基因表達；C、D：hUCMSCs/PHBHHx植入5個月Ⅰ型膠原、骨橋蛋白的基因表達；1：實驗組；2：對照組。

圖6hUCMSCs/PHBHHx復合物的基因表達

3　討　　論

種子細胞的獲取是骨組織工程研究的基礎。體外分離擴增hUCMSCs的方法目前主要有酶消化法和組織塊貼壁法。前者具有快速分離MSCs的優勢，但酶體系有可能降解細胞外膜，甚至對細胞造成損傷，影響細胞貼壁。本實驗選用組織塊貼壁法對華通膠來源的hUCMSCs進行體外分離培養，研究結果與徐燕等[8]的一致，該方法能更加簡單、經濟、快捷地分離出具有高增殖活性及多向分化潛能的MSCs。

可吸收支架材料是骨組織工程的核心要素之一。材料的物理性質會對細胞的黏附等產生很大的影響，親水性的表面有利于細胞的黏附和生長，多孔結構用于營養物質的滲透和細胞的正常代謝。一般通過表面改性的方法加以改進，如通過培養基浸泡離子注入，多聚賴氨酸包埋等對材料表面進行修飾以改善其親水性和細胞吸附性[9-10]。本實驗通過用完全培養基浸泡支架材料的方法，提高材料的親水性，結果發現：材料上的細胞數量增多，呈梭形或多角形，表面光滑，增殖較快。說明用完全培養基浸泡后的材料更能模擬細胞的體外生長環境，有利于細胞的黏附和增殖。

hUCMSCs/PHBHHx復合物植入裸鼠背部皮下，誘導組細胞/支架復合物的大小形態于第1、3、5個月基本保持原狀，但質地變硬。HE染色誘導組1個月時見骨組織雛形，3個月時見較多編織骨組織及哈弗斯系統雛形，5個月時見較多板層骨組織及哈弗斯系統樣結構，這說明植入物在體內經歷5個月的成熟并逐漸成骨。Ⅰ型膠原免疫組織化學及ALP染色由弱陽性-陽性-強陽性的過程正好印證了植入物在體內的成骨情況。以上均表明誘導組在脫離體外誘導環境后hUCMSCs并未失去成骨細胞表型同時能繼續增殖及分泌細胞外基質，可以代償PHBHHx的降解而維持整個復合物的原有形態。對照組PHBHHx則不能保持原狀，體積逐漸縮小至完全降解。HE染色1個月時PHBHHx表面有較多的炎性細胞，見明顯材料殘留；3個月時PHBHHx表面有少量的炎性細胞，無明顯材料殘留。相關特異性指標均為陰性。提示PHBHHx作為支架材料在體內有良好的生物相容性和合適的降解率。

RT-PCR檢測又從基因層面驗證了以上結果，其中Ⅰ型膠原蛋白在第3、5個月時基因表達均呈陽性，而OPN基因表達在第3個月時呈陰性，第5個月時呈弱陽性。可能因為OPN是成骨分化中晚期的標志，細胞/支架復合物經體外誘導植入體內成骨需要一定的時間積累，要形成成熟的骨組織，還需要體內相關環境因素的作用[11-14]，如生理刺激等[15]。

本實驗基于骨組織工程的基本原理，結果提示PHBHHx復合hUCMSCs經體外成骨誘導后具有在裸鼠體內異位構建組織工程骨的能力，為初步構建組織工程骨提供實驗依據。但細胞上架率低、分布不均勻、PHBHHx仍存在親水性等方面的不足需要在以后的實驗中進一步改進。

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Heterotopic osteogenesis in vivo of PHBHHx and human umbilical cord mesenchymal stem cells*

MaMinxian1，HeZhixu2，WangMei3，YeChuan4,WangYong1，ZengXiao1，ZhangJunbiao1，LiuQin1

(1.DepartmentofProsthodontics,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China; 2.CenterofStemCellsandTissueEngineering,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China; 3.DepartmentofProsthodontics,GuiyangMunicipalStomatologicalHospital,Guiyang,Guizhou550002,China; 4.DepartmentofOrthopedic,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicialUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

ObjectiveTo explore the ability for constructing tissue engineering bone in vivo in complex scaffolds with PHBHHx as the scaffolds material and human umbilical cord mensenchymal stem cells (hUCMCs) as the seed cells.MethodshUCMSCs were inoculated into PHBHHx scaffolds to induce osteogenesis culture in vivo for two weeks,the the induced group was the experimental group and those without instilling hUCMCs served as the control group,the nude mouse subcutaneous implantation was performed.Then taking material at 1,3,5 months after implantation in vivo was performed for conducting HE,collagenⅠimmunohistochemical,alkaline phosphatase staining and RT-PCR.ResultshUCMSCs showed good cellular adsorbability.The size and form in the experimental group basically maintained the original status,and the osteogenesis specific indicators were positive;but the control group did not keek the original status,its volume was gradually shrunk until complete degradation,and the osteogenesis specific indicators were negative.ConclusionThe PHBHHx scaffolds combined with hUCMSCs has the capability of in vivo heterotopic constructing tissue engineering bone in nude mouse by in vitro osteogenic induction.

mesenchymal stem cells;tissue engineering;bone;PHBHHx

貴州省科學技術基金資助項目[黔科合J字(2010)2177號]；貴州省科學技術聯合基金資助項目[黔科合LG字(2012)002號]。作者簡介：馬敏先(1971-)，副主任醫師，碩士，主要從事種植及骨組織工程方面的研究。

R68

A

1671-8348(2016)20-2740-04

2015-12-08

2016-02-26)

·論著·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.002