全反式維甲酸對高糖環境下HK-2細胞轉分化的影響及其可能機制

秦曉華，陳艷霞，涂衛平，黃　翀，房向東，鄒宏昌，徐承云

(南昌大學第二附屬醫院腎內科　330006)

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全反式維甲酸對高糖環境下HK-2細胞轉分化的影響及其可能機制

秦曉華，陳艷霞，涂衛平△，黃翀，房向東，鄒宏昌，徐承云

(南昌大學第二附屬醫院腎內科330006)

目的探討全反式維甲酸(ATRA)對高糖環境下正常人腎小管上皮HK-2細胞株轉分化的影響及其可能機制。方法將體外培養的HK-2 細胞按隨機數字表法分為以下7組：空白組、高糖組、高滲組、高糖+低濃度ATRA組、高糖+中濃度ATRA組、高糖+高濃度ATRA組、Rho激酶抑制劑Y27632干預組。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測各組細胞 RhoA及ROCK1 mRNA表達水平，采用細胞免疫熒光檢測高糖環境下HK-2細胞α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA) 及E-鈣黏蛋白的表達變化。結果RT-PCR結果顯示：空白組與高滲組RhoA及ROCK1 mRNA表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；高糖組RhoA及ROCK1 mRNA表達水平較空白組、高滲組高，差異均有統計學意義(P<0.05)；予以ATRA或Y27632干預后，RhoA及ROCK1 mRNA表達較高糖組減少，差異均有統計學意義(P<0.05)，且呈現ATRA濃度依賴性。相關性分析示，高糖組及各ATRA干預組RhoA mRNA與ROCK1 mRNA表達水平呈正相關(P<0.05)。細胞免疫熒光檢測結果顯示：空白組與高滲組α-SMA及E-鈣黏蛋白表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；高糖組α-SMA表達水平較空白組高，E-鈣黏蛋白表達水平較空白組低，差異均有統計學意義(P<0.05)；予以ATRA或Y27632干預后，α-SMA表達明顯減少，E-鈣黏蛋白表達明顯增多，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論ATRA可部分逆轉高糖環境下HK-2細胞轉分化的過程，其機制可能與抑制RhoA/ROCK信號通路有關。

全反式維甲酸；腎小管上皮細胞；α-平滑肌肌動蛋白；E-鈣黏蛋白；RhoA/Rho激酶信號通路

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要的微血管并發癥之一，其主要特點是蛋白尿并伴有腎小球濾過率下降。全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是維生素A的活性代謝產物，在機體中能誘導細胞生長、分化及凋亡，同時其在基因調節方面也起著重要作用[1]。最近研究報道，ATRA由于能減少轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的表達，抑制單核細胞趨化肽1的上調，被認為具有緩解腎損傷，保護腎臟的作用[2]。然而，其具體作用機制仍在探索之中。本試驗以人腎小管上皮細胞(HK-2細胞)為研究對象，探索ATRA對RhoA/Rho激酶(ROCK)信號通路的影響，進一步探索其保護腎臟的可能機制，為臨床治療DN提供新思路。

1　材料與方法

1.1細胞來源人腎小管上皮細胞株(HK-2細胞株)購自美國模式培養物集存庫(ATCC)。

1.2儀器與試劑ATRA、Rho激酶抑制劑Y27632、D-葡萄糖、甘露醇(美國Sigma公司)； DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)/F12培養基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(BSA)、0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)；Trizol、引物(美國Invitrogen公司)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(北京全式金公司)。核酸微量蛋白測定儀、PCR擴增儀、凝膠圖像成像系統(美國Bio-Rad公司)，DYPC-31DN型電泳儀(北京六一儀器廠)，鼠抗人單克隆α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscleactin，α-SMA)抗體、鼠抗人單克隆E-鈣黏蛋白(epithelial- cadherin，E-cadherin)抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標記抗小鼠IgG(北京中杉金橋公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養及試驗分組HK-2細胞培養條件：含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，37 ℃ 5% CO2培養箱培養。待HK-2細胞在培養瓶中生長至70%～80%融合時進行傳代，傳代后生長至約80%融合后改用無血清DMEM/F12繼續培養24 h。將體外培養的HK-2細胞按隨機數字表法分為以下7組：(1)空白組；(2)高糖組(D-葡萄糖濃度為30 mmol/L)；(3)高滲組(甘露醇濃度為24.5 mmol/L)；(4)高糖+低濃度ATRA組(ATRA濃度為10-7mol/L)、(5)高糖+中濃度ATRA組(ATRA濃度為10-6mol/L )、(6)高糖+高濃度ATRA組(ATRA濃度為10-5mol/L)；(7)Rho激酶抑制劑Y27632干預組(高糖+Y27632，Y27632濃度為30 μmol/L)，予以高糖培養30 min后再加入Y27632進行干預。各試驗組細胞干預48 h，試驗重復3 次。

1.3.2RT-PCR檢測收集各組細胞總RNA，檢測RNA完整性后測定RNA濃度。取總RNA 1.5 μg進行逆轉錄反應合成cDNA，取cDNA 2 μL在2×EasyTaq PCR Super Mix的作用下擴增目標基因，總反應體系50 μL。PCR擴增條件： 94 ℃預變性5 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸7 min，共35個循環。PCR產物電泳儀內120 V，電泳30 min，凝膠成像系統成像并使用Quantity One軟件進行數據分析。RhoA、ROCK1及β-肌動蛋白(β-actin)引物序列及產物長度，見表1。

1.3.3細胞免疫熒光6孔培養板中的細胞用4%多聚甲醛固定20 min(置于4 ℃冰箱)，用0.1% Triton穿孔15 min，5% BSA封閉液室溫封閉30 min后，各孔中滴加鼠抗人單克隆α-SMA 抗體(抗體按1∶200稀釋，5% BSA封閉液配制)或鼠抗人單克隆 E-cadherin抗體4 ℃孵育過夜后取出室溫恢復30 min，加入FITC標記抗小鼠IgG二抗，置37 ℃孵箱孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察。每組細胞隨機選取10個視野攝像，熒光圖片用 Image-Pro Plus 6.0軟件分析，每個視野積分吸光度值與測量面積的比值為平均熒光強度(即蛋白相對表達量)。

表1　　RhoA、ROCK1及β-actin引物序列和產物長度

2　結　　果

2.1各組HK-2細胞RhoA及ROCK1 mRNA表達水平比較空白組與高滲組RhoA及ROCK1 mRNA表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；高糖組RhoA及ROCK1 mRNA表達水平較空白組、高滲組升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；予以ATRA或Y27632干預組RhoA及ROCK1 mRNA表達水平較高糖組減少，差異均有統計學意義(P<0.05)，且呈現ATRA濃度依賴性。見圖1、表2。

M：蛋白質標記物；1：空白組；2：高糖組；3：高滲組；4：高糖+低濃度ATRA組；5：高糖+中濃度ATRA組；6：高糖+高濃度ATRA組；7：Y27632干預組。

圖1各組HK-2細胞RhoA mRNA及ROCK1mRNA的表達情況

2.2相關性分析Pearson直線相關分析示：高糖組及各ATRA干預組RhoA mRNA與ROCK1 mRNA表達水平呈正相關(P<0.05)。

表2　　各組HK-2細胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA表達水平比較

續表2　　各組HK-2細胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA表達水平比較

*：P<0.05，與空白組比較；#：P<0.05，與高糖組比較；△：P<0.05，與高糖+低濃度ATRA組比較；▽：P<0.05，與高糖+中濃度ATRA組比較。

表3　　RhoA mRNA與ROCK1 mRNA的相關性

2.3各組HK-2細胞α-SMA及E-cadherin表達水平比較細胞免疫熒光檢測結果顯示：空白組與高滲組α-SMA、E-cadherin表達水平比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；高糖組α-SMA表達水平較空白組高，E-cadherin表達水平較空白組低，差異均有統計學意義(P<0.05)；予以ATRA或Y27632干預后，α-SMA表達明顯減少，E-cadherin表達明顯增多，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4　　各組HK-2細胞α-SMA及E-cadherin表達水平比較

*：P<0.05，與空白組比較；#：P<0.05，與高糖組比較；△：P<0.05，與高糖+低濃度ATRA組比較；▽：P<0.05，與高糖+中濃度ATRA組比較。

3　討　　論

本研究RT-PCR結果顯示，各ATRA或Y27632干預組HK-2細胞RhoA及ROCK1 mRNA表達水平均較高糖組降低，呈現ATRA濃度依賴性。且高糖組及各ATRA干預組RhoA與ROCK1 mRNA表達水平呈正相關。這表明高糖可通過RhoA/ROCK信號通路誘導HK-2細胞損傷，而ATRA通過抑制RhoA/ROCK信號通路能緩解由高糖引起的腎損傷。細胞免疫熒光結果顯示，高糖組α-SMA表達水平較空白組明顯升高，E-cadherin表達水平較空白組明顯降低，予以ATRA或Y27632干預后，α-SMA表達明顯減少，E-cadherin表達明顯增多。免疫熒光結果提示，ATRA可通過促進HK-2細胞E-cadherin表達及減少α-SMA表達保護腎臟。

ATRA是維生素A的代謝產物，其通過調節細胞因子的產生參與機體免疫和炎性反應。最近研究表明，ATRA通過上調LIM同源盒轉錄因子1-β(LIM homeobox transcription factor 1-beta，LMX1B)的表達，下調TGF-β1、Ⅳ型膠原蛋白和纖維蛋白的表達，參與因缺氧(復氧)引起的腎小管上皮細胞損傷的修復[3]。Wan等[4]通過將ATRA作用于腎臟細胞后也發現，ATRA通過抑制核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號通路與結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)的表達，可減少因缺氧導致的腎損傷[4]。Molina-Jijón等[2]在糖尿病腎病(DN)動物模型中觀察到，DN腎臟中常伴有ATRA代謝調節紊亂，提示ATRA的改變可能是糖尿病腎病發病起因的新特點。進一步研究顯示，ATRA通過減弱氧化應激與防止腎臟緊密連接蛋白的丟失參與腎臟的保護[2]。然而，糖化清蛋白(glycated albumin，GA)在人系膜細胞中能呈劑量依賴性地增加細胞內的氧化應激及COX-2和VCAM-1分子的表達，ATRA在人系膜細胞中能將GA的這種作用放大3～4倍，被認為是DN新的病理生理特點[5]。

RhoA/ROCK信號通路是DN導致腎臟纖維化的重要通路之一，其可通過影響轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、血管緊張素Ⅱ、NF-κB的分泌，激活并增強其信號通路，介導腎臟纖維化[6]。國內外關于ATRA能否通過RhoA/ROCK信號通路對腎臟細胞產生影響的文獻報道較少。本研究證實，ATRA可通過抑制RhoA/ROCK信號通路促進E-cadherin表達及減少α-SMA表達，緩解因高糖引起的HK-2轉分化，參與腎臟保護，抑制腎臟纖維化。

[1]Zhou TB，Qin YH，Ou C，et al．All-trans retinoic acid can regulate the expressions of gelatinases and apolipoprotein E in glomerulosclerosis rats[J]．Vascul Pharmacol，2011，55(5/6)：169-177.

[2]Molina-Jijón E，Rodríguez-Muoz R，Namorado-Mdel C，et al．All-trans retinoic acid prevents oxidative stress-induced loss of renal tight junction proteins in type-1 diabetic model[J]．J Nutr Biochem，2015，26(5)：441-454.

[3]Zhou TB，Ou C，Jiang ZP，et al．Potential signal pathway between all-trans retinoic acid and LMX1B in hypoxia-induced renal tubular epithelial cell injury[J]．J Recept Signal Transduct Res，2016，36(1)：53-56.

[4]Wan X，Li X，Bo H，et al．All-trans retinoic acid protects renal tubular epithelial cells against hypoxia induced injury in vitro[J]．Transplant Proc，2013，45(2)：497-502．

[5]Alique M，Moreno-Manzano V，Sepúlveda-Muoz JC，et al．All-trans retinoic acid and glycated albumin reciprocally influence their effects in human mesangial cells[J]．Int J Vitam Nutr Res，2005，75(1)：47-53.

[6]Kolavennu V，Zeng L，Peng H，et al．Targeting of RhoA/ROCK signaling ameliorates progression of diabetic nephropathy independent of glucose control[J]．Diabetes，2008，57(3)：714-723.

秦曉華(1976-)，副主任醫師，碩士，主要從事腎臟病的臨床及基礎研究。△

,E-mail:tuweiping6102@sina.com。

R587.1

B

1671-8348(2016)20-2853-03

2016-01-12

2016-03-15)

·經驗交流·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.040