微量元素鍶對非酒精性脂肪肝大鼠的防治作用研究

關橋偉，肖業偉，余　廣，馮志強，盤強文

(西南醫科大學基礎醫學院，四川瀘州 646000)

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微量元素鍶對非酒精性脂肪肝大鼠的防治作用研究

關橋偉，肖業偉，余廣，馮志強，盤強文△

(西南醫科大學基礎醫學院，四川瀘州 646000)

目的探討微量元素鍶對大鼠脂代謝紊亂的改善及非酒精性脂肪肝的防治作用及可能機制。方法將50只SD大鼠分為5組，對照組用普通飼料，其余4組用高脂飼料，共喂養13周。18 mg/L鍶組和36 mg/L鍶組在后9周分別給予18 mg/L與36 mg/L的鍶水，辛伐他汀組于后4周每天給予10 mg/kg辛伐他汀灌胃。第14周末處死大鼠，檢測肝指數、血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及肝組織TG和TC含量，肝組織冰凍切片，油紅 O 染色觀察脂肪樣變及其分布情況。結果與對照組比較，脂肪肝模型組的肝指數、肝TC、肝TG、血清TC、LDL-C均升高(P<0.05)；與脂肪肝模型組比較，18 mg/L鍶組大鼠血清TC、LDL-C、HDL-C也降低(P<0.05)；36 mg/L鍶組肝指數、肝TC、肝TG、血清TC、LDL-C均降低(P<0.05)。油紅O染色結果顯示：脂肪肝模型組肝組織含有大量的紅染脂肪顆粒；18 mg/L鍶組、36 mg/L鍶組以及辛伐他汀組紅染顆粒含量均較脂肪肝模型組有不同程度減少。結論長期較高濃度的微量元素鍶攝入具有改善大鼠脂代謝紊亂，防治非酒精性脂肪肝的作用。

鍶；非酒精性脂肪肝；辛伐他汀；脂代謝紊亂

隨著人們生活水平的提高，肥胖人群的比例在不斷增大。超質量人群最常見的疾病是以脂代謝紊亂為主[1]的非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)，由于NAFLD與糖尿病、動脈粥樣硬化及冠心病等密切相關，因此其日益受到基礎與臨床醫學研究者的重視。目前，服用他汀類藥物是治療脂肪肝最有效的手段，但是，已有研究證實他汀有提高2型糖尿病發病率、造成橫紋肌溶解及導致皮疹等不良反應。本教研室及合作實驗室在前期研究中，觀察到飲用高濃度鍶(Strontium，Sr)水具有降低動物血脂的作用，并推測鍶可能有助于預防和治療脂肪肝。鑒于此，本文擬通過對NAFLD大鼠模型的觀察，以探討鍶在改善脂代謝、防治脂肪肝過程中的具體作用和可能機制，為鍶在改善脂代謝紊亂的臨床應用提供實驗性理論依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康雄性Spraque-Dawley 大鼠50只， 5～6周齡，體質量120～170 g，清潔級，由西南醫科大學動物實驗中心提供，動物許可證號：SYXK(川)2013-065。

1.2儀器與試劑辛伐他汀(simvastatin,SIMVA)購自湖北廣濟藥業股份有限公司(批號：20140601)；氯化鍶購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司(批號：MKBJ8678V)；膽固醇購自上海藍季科技發展有限公司(批號：140103)；脫氧膽酸鈉購自北京索萊寶科技有限公司(批號：D8160)；丙基硫氧嘧啶購自上海藍季科技發展有限公司(批號：140312)；總膽固醇(TC)與三酰甘油(TG)測定試劑盒購自長春匯力生物技術有限公司(批號：2014043/2014034)，油紅O購自北京索萊寶科技有限公司(批號：313B058)；ELX800酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1實驗分組健康雄性SD大鼠50只，適應性飼養1周后分為5組，每組10只。對照組采用基礎飼料喂養，從第10周開始每天給予3 mL生理鹽水灌胃；其余4組用高脂飼料[2](基礎飼料77.6%、脫氧膽酸鈉0.2%、丙基硫氧嘧啶0.2%、膽固醇2.0%、豬油10.0%、蛋黃粉5.0%、蔗糖5.0%)喂養13周。脂肪肝模型組(NAFLD)從第10周開始每天3 mL生理鹽水灌胃；18 mg/L鍶組(Sr18組)從第5周開始給予18 mg/L Sr飲用水，另從第10周開始每天加上3 mL 18 mg/L Sr水灌胃； 36 mg/L鍶組(Sr36組)從第5周開始給予36 mg/L Sr飲用水，另從第10周開始每天加上3 mL 36 mg/L Sr水灌胃；辛伐他汀組(SIMVA組)從第10周開始每天給予10 mg/kg辛伐他汀灌胃。

1.3.2一般情況觀察實驗期間觀察并記錄各組大鼠每天飼料用量，動物的飲食量、毛發、大小便、行為及整體狀況。

1.3.3標本采集及指標測定實驗第14周末全部大鼠禁食12 h，稱體質量后以2%的戊巴妥鈉溶液1 mL/kg腹腔注射麻醉后剖腹，腹主動脈取血，分離血清后送西南醫科大學附屬醫院檢驗科測定血清丙氨酸氨基轉移酶(alamine aminotrasferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotrasferase，AST)、三酰甘油 (triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)；迅速分離取出完整肝臟，稱肝濕重以計算肝指數:(肝濕重/體質量)×100%；取相同部位肝右葉組織500 mg與氯仿-甲醇混合液(1∶1)制備成10%勻漿液，靜置過夜，離心取上清液檢測TG和TC水平(按相應的試劑盒說明書進行)；取相同部位肝右葉，OCT包埋，-80 ℃冷凍后，作15 μm冰凍切片，用油紅O染色法觀察肝組織中脂質沉積情況。

2　結　　果

2.1動物的一般情況實驗期間，對照組大鼠精力充沛，皮毛干凈整齊，飲食及大小便正常；NAFLD組大鼠前幾周無明顯改變，隨時間的增長，后期逐漸出現精神變差，活動減緩，反應減慢，毛色偏黃，大便較稀等；Sr18 組、Sr36組及SIMVA組大鼠飲食等一系列性狀均較NAFLD組有不同程度改善。

2.2肝指數NAFLD組、Sr18組、Sr36組及SIMVA組肝指數均高于對照組(P<0.05)；Sr36組及SIMVA組肝指數均低于NAFLD組(P<0.05)，見圖1。

2.3血清ALT及AST活性的改變Sr36組血清ALT水平低于對照組(P<0.05)，Sr18組、Sr36組及SIMVA組血清AST水平均低于對照組(P<0.05)；Sr18組、Sr36組血清ALT水平均低于NAFLD組(P<0.05)，Sr18組、Sr36組及SIMVA組血清AST水平均低于NAFLD組(P<0.05)，見圖2。

#：P<0.05，與對照組比較；*：P<0.05，與NAFLD組比較。

圖1肝指數比較

#：P<0.05，與對照組比較；*：P<0.05，與NAFLD組比較。

圖2血清ALT和血清AST

2.4血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、肝TC和肝TG的水平變化NAFLD組、Sr18組、Sr36組及SIMVA組血清TC、LDL-C、HDL-C水平均高于對照組(P<0.05)，NAFLD、Sr18、Sr36組及SIMVA組血清TG水平均低于對照組(P<0.05)，NAFLD、Sr18組肝TC、TG水平均高于對照組(P<0.05)；與NAFLD組比較，對照組、Sr18組和Sr36組血清TC及血清LDL-C水平均低于NAFLD組(P<0.05)，對照組、Sr36組及SIMVA組肝TC和肝TG水平均低于NAFLD組(P<0.05)，對照組和Sr18組血清HDL-C水平均低于NAFLD組(P<0.05，表1)。

2.5油紅O染色結果油紅O染色顯示對照組肝臟中未見明顯紅染顆粒，結構正常，肝細胞排列整齊；NAFLD組肝臟有肝細胞脂肪變性，體積增大，含有大量的紅染顆粒，細胞核被推向周邊，脂質沉積明顯增多，結構被破壞，肝細胞排列紊亂；Sr18、Sr36組及SIMVA組肝細胞的結構，排列，紅染顆粒含量等改變較NAFLD組有不同程度改善，見圖1。

表1　　血清TC、TG、LDL-C、HDL-C和肝TC、TG含量

#:P<0.05,與對照組比較；*:P<0.05,與NAFLD組比較。

紅色顆粒：油紅O示脂肪滴沉積；A1、A2：對照組(×100、×400)；B1、B2：NAFLD組(×100、×400)；C1、C2：NAFLD組(×100、×400)；D1、D2：NAFLD組(×100、×400)；E1、E2：NAFLD組(×100、×400)；

圖3肝組織脂肪沉積(油紅O染色)及形態學改變

3　討　　論

NAFLD的動物模型制備方法很多，本文以微調后的高脂配方飼料[2]喂養SD大鼠以制備NAFLD動物模型，預示實驗觀察到第9周末動物肝臟呈輕、中度脂肪樣變。本實驗觀察到NAFLD模型組大鼠血清TC及LDL-C水平升高，肝指數、肝TC和TG均升高，油紅O染色肝組織中出現大量紅染的脂肪滴，由此證實大鼠非酒精性脂肪肝模型復制成功，但本實驗所得NAFLD模型的血清TG水平并未升高，反而HDL-C水平升高，這與常見的NAFLD患者的血清學改變并不一致，可能與飼料的配方有關，其具體機制有待進一步研究。

NAFLD的發病機制非常復雜，目前的治療方式主要有：改善膳食結構；適當增加運動，控制體質量；改正不良生活習慣及適當的藥物治療等。當今臨床治療脂肪肝使用廣泛且最有效的藥物是他汀類，其作用機制為抑制羥甲戊二酰輔酶A還原酶活性，阻斷膽固醇合成，同時促進LDL-C的降解[3]。本實驗觀察到SIMVA組肝TC、TG均降低，ORO結果顯示肝臟中見少量紅染顆粒，可見辛伐他汀對NAFLD的療效非常明確，與文獻報道基本一致，這也進一步證實了本實驗的方法和結果的真實可靠。但是，已有研究證實他汀類藥物具有提高2型糖尿病發病率[4]、引起橫紋肌溶解及導致皮疹等不良反應[5-6]。鑒于此，尋找更安全、經濟、有效且更易被患者接受的NAFLD防治方式是非常有必要的。

鍶是人體必需的14種微量元素之一，有研究指出飲用一定量的鍶水對人體有益[7]。但是，我國淡水資源中鍶含量較低，平時攝入的鍶往往滿足不了生理需要[8]，因此考慮將鍶作為食品和飲料的添加劑是有必要且可行的。目前，鍶在臨床上的應用及研究主要集中于骨轉移瘤和骨質疏松的治療[9-11]。本教研室及合作實驗室在前期研究中，觀察到飲用高濃度鍶水有降低動物血脂的作用。李牧等[12]指出鍶可延緩動脈粥樣硬化斑塊的形成，在一定范圍內隨著鍶濃度升高，作用越好，其機制與改善脂代謝有關。萬英等[13]研究指出2～8 mg/L含鍶礦泉水飲用6個月對正常大鼠血清中ALT、AST、乳酸脫氫酶(lactte dehydrogenase,LDH)、TG和TC無不良影響。汪澍等[14]觀察到鍶礦泉水可以降低2型糖尿病大鼠的TC與TG水平，且聯合格列美脲療效更好，因此推測鍶可能具有延緩2型糖尿病發展的作用。但是，鍶是否具有預防和治療非酒精性脂肪肝的作用及其作用機制國內外未見報道。

本實驗所用鍶的劑量處于大鼠的安全劑量內，遠小于大鼠的中毒劑量。結果顯示：18 mg/L鍶組雖然大鼠血清TC、LDL-C降低，但是血清HDL-C也降低；36 mg/L鍶組肝指數、肝TC、肝TG、血清TC、LDL-C均降低。可見，長期較高濃度的鍶攝入可以有效地減輕NAFLD，改善肝臟脂代謝紊亂，其療效接近辛伐他汀。但是，鍶可以作為食品和(或)飲料的添加劑而不是藥物，因此其可能會成為一種更安全、更經濟、有效且更易被患者接受的NAFLD的防治方式。

鍶又是如何改善脂代謝紊亂減輕NAFLD的呢？目前認為關于脂質代謝的機制有以下幾種可能。(1)膽固醇代謝：既可通過甲羥戊酸途徑，以乙酰CoA等原料合成內源性膽固醇，又可通過低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLr)內吞攝入外源性膽固醇。其合成調控主要有：①固醇調節元件(sterol regulatory element binding protein,SREBPs)與裂解激活蛋白(Sterol regulatory element binding protein cleavage activator protein,SCAP)形成SCAP-SREBP復合物，通過SREBP通路抑制合成膽固醇基因的表達[15]；②通過羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶蛋白降解通路，進而減少膽固醇的合成[16]。膽固醇的降解則主要是通過三磷酸腺苷途徑。(2)三酰甘油代謝。合成途徑：①甘油一酯與脂酰CoA在脂酰轉移酶作用下，生成三酰甘油。②糖酵解的中產物，類磷酸二羥丙酮和游離甘油分別在甘油磷酸脫氫酶和甘油激酶的催化下，生成3-磷酸甘油，進而與脂酰CoA作用生成三酰甘油的前體-磷脂酸，再進一步合成三酰甘油。三酰甘油的主要分解途徑是在三酰甘油脂肪酶、激素敏感酶、環磷酸腺苷依賴蛋白激酶等的作用下，三酰甘油逐步分解為甘油和脂肪酸。本實驗的結果顯示，較高濃度的鍶攝入可以顯著降低血清和肝的膽固醇水平，由此推測微量元素鍶可能具有促進三磷酸腺苷途徑以加速膽固醇的降解，或者作用于SREBP通路和/或羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶蛋白降解通路以抑制膽固醇合成、降低肝內膽固醇水平，同時促進LDLr內吞以降低血清膽固醇水平的作用。本實驗同時也觀察到較高濃度的鍶攝入雖可降低肝內三酰甘油水平，但對血清三酰甘油的影響卻很小，這也許與鍶的調節位點或鍶的用量大小有關。至于鍶改善脂質代謝紊亂的具體作用機制，尤其是其對脂代謝調節過程中的關鍵生物信號分子的影響，則有待進一步的研究。

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Prevention and treatment effects of trace element strontium on non-alcoholic fatty liver disease in rats

GuanQiaowei,XiaoYewei,YuGuang,FengZhiqiang,PanQiangwen△

(CollegeofPreclinicalMedicine,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of trace element strontium on the improvement of rat lipid metabolism disorder,prevention and treatment effects on non-alcoholic fatty acid liver disease (NAFLD) and its possible mechanism.MethodsFifty SD rats were randomly divided into 5 groups.The control group used the common fodder and the other four groups adopted the high fat fodder for 13-week feeding.During the final 9 weeks,the strontium 18 mg/L group and the strontium 36 mg/L group were separately fed with 18 mg/L and 36 mg/L of strontium water.During the final 4 weeks,the simvastatin group was gavaged with simvastatin 10 mg/kg.The rats were killed at the end of 14 weeks and the liver index,serum ALT,AST,TG,TC,LDL-C and HDL-C,and liver TG,TC levels were measured.The liver tissue frozen section was performed.The fatty change and its distribution were observed by oil red O staining.ResultsCompared with the control group,the liver indexc,liver TG and TC levels,serum TC and LDL-C in the NAFLD model group were statistically increased (P<0.05);compared with the NAFLD model group,the levels of serum TC and LDL-C in the strontium 18 mg/L group were decreased,but serum HDL-C was also decreased(P<0.05);in liver index,liver TC and TG levels,serum TC and LDL-C in the strontium 36 mg/L group were decreased(P<0.05).The oil red O staining showed that the liver tissue in the NAFLD model group contained a large amount of red staining fat particles;but which in the strontium 18 mg/L group,strontium 36 mg/L group and the simvastatin group were decreased to some extents.ConclusionThe long term high concentration trace element strontium intake has the effect for improving the rat lipid metabolic disorder and preventing and treating NAFLD.

strontium;non-alcoholic fatty acid liver disease;simvastatin;disorder of lipid mechanism

關橋偉(1989-),在讀碩士，主要從事生理學方面的研究。△

，E-mail:qwpan@qq.com。

R575

A

1671-8348(2016)20-2744-04

2015-12-18

2016-03-02)

論著·基礎研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.003