Six1、TGF-β、VEGF-C在人喉鱗癌中的表達及相關性分析

張繼華,徐文霞，王　來,祖金美

(河北醫科大學第一醫院耳鼻咽喉科,石家莊 050031)

?

Six1、TGF-β、VEGF-C在人喉鱗癌中的表達及相關性分析

張繼華,徐文霞，王來,祖金美△

(河北醫科大學第一醫院耳鼻咽喉科,石家莊 050031)

目的檢測Six1、轉化生長因子-β(TGF-β)及其共同誘導的血管內皮生長因子(VEGF)-C蛋白在人喉鱗癌中的表達，探討三者在喉鱗癌發生、發展、轉移及預后中的意義。方法收集病理學確診的96例手術后喉鱗癌患者的臨床資料和留存石蠟標本。采用免疫組織化學和Western blot法檢測喉鱗癌組織中Six1、TGF-β及VEGF-C蛋白的表達情況，并分析上述蛋白表達與喉鱗癌患者臨床特征的關系。結果96例喉癌組織標本中，Six1、TGF-β、VEGF-C的陽性表達率分別為84.4%(81/96)、89.6%(86/96)和91.7%(88/96)。Six1陽性表達率在低分化、有淋巴結轉移的喉鱗癌患者中較高；TGF-β陽性表達率在有淋巴結轉移的喉鱗癌患者中較高，同分化程度無關；VEGF-C陽性表達率在低分化、有淋巴結轉移的喉鱗癌患者中較高；人喉鱗癌組織中Six1的表達與VEGF-C表達呈正相關。結論Six1、TGF-β、VEGF-C的高表達可能促進了喉鱗癌的淋巴轉移，Six1的表達可能是VEGF-C表達變化的重要影響因素之一。聯合檢測Six1、TGF-β、VEGF-C對判斷人喉鱗癌的轉移及預后有重要臨床意義。

Six1；轉化生長因子-β；血管內皮生長因子-C；喉腫瘤；淋巴轉移

喉癌是耳鼻喉科的常見惡性腫瘤，在頭頸部惡性腫瘤中發病率較高。淋巴轉移是喉癌死亡率居高不下的主要原因，淋巴轉移有賴于新生淋巴管的生成，血管內皮生長因子(VEGF)-C被認為是腫瘤新生淋巴管生成的最重要因素[1]。最近研究表明， Six1(sine oculis homeobox homolog 1)、轉化生長因子-β(TGF-β)能夠共同作用促進多種腫瘤細胞VEGF-C的表達，進一步促進腫瘤淋巴管的生成及淋巴結的轉移[2]。但其具體的作用機制尚不明確。本研究對96例喉鱗癌患者腫瘤組織中Six1、TGF-β和VEGF-C蛋白的表達進行了檢測，旨在探討3種蛋白在喉鱗癌淋巴轉移中的作用關系，為臨床診治提供理論參考。

1　資料與方法

1.1一般資料收集2013年1～12月河北醫科大學第一醫院及第四醫院收治術前未經放化療的96例喉鱗癌患者標本，其中聲門型38例，聲門上型58例；取自距腫瘤切緣大于0.5 cm癌旁組織32例，經病理證實無瘤細胞浸潤、炎癥表現、細胞增生等病變。96例喉癌標本來源于男性患者79例，女性患者17例；患者年齡32～76歲，平均58歲；其中39例術后病理證實有淋巴結轉移，57例無淋巴結轉移，按2002年UICC TNM分期標準：39例有淋巴結轉移患者中T1N1M06例，T1N2M05例，T2N1M08例，T2N2M09例，T3N1M07例，T3N2M02例，T4N1M02例，T4N2M00例；57例未見淋巴結轉移患者中T1N0M014例，T2N0M018例，T3N0M013例，T4N0M012例；臨床分期Ⅰ期22例,Ⅱ期28例,Ⅲ期35例，Ⅳ期11例。腫瘤分化程度：高分化45例，中分化16例，低分化35例。所有標本均經兩位副高以上職稱的病理科醫生復查確診。

1.2主要試劑兔抗人Six1多克隆抗體購自博士德生物工程有限公司，工作濃度為1∶70。兔抗人TGF-β蛋白多克隆抗體購自博士德生物工程有限公司，工作濃度均為1∶50。兔抗人VEGF-C蛋白多克隆抗體購自北京奧維亞生物技術有限公司， 工作濃度為1∶50。S-P試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學染色石蠟包埋組織塊做厚度5 μm連續切片，SP法免疫組織化學染色，PBS代替一抗作陰性對照，用已知的陽性病例做陽性對照。主要步驟如下：將切片置于0.01 mol/L、pH6.0的檸檬酸緩沖液中，高溫高壓熱修復抗原2 min。待其溫度恢復至室溫后，蒸餾水沖洗2次，PBS液浸洗5 min。3%的雙氧水孵育10 min，蒸餾水沖洗2次，0.1 mol/L PBS液浸洗5 min。加一抗，用0.1 mol/L PBS代替一抗作陰性對照，37 ℃孵育1 h。0.1 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min。加二抗，37 ℃孵育30 min，0.1 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min。加DAB顯色液顯色，顯微鏡下控制顯色時間，自來水終止顯色5 min。蘇木素復染細胞核5 min，再依次經過1%酸性酒精分化(30 s)、1%氨水返藍(1 min)、70%乙醇(10 min)、80%乙醇(10 min)、90%乙醇(10 min)、100%乙醇Ⅰ(20 min)、100%乙醇Ⅱ(20 min)、二甲苯Ⅰ(20 min)、二甲苯Ⅱ漂洗(20 min)、中性樹脂封片。

1.3.2Western blot常規提取組織蛋白，制備樣品，測定各組蛋白的濃度，點樣(12%分離膠和4% 濃縮膠)，每個樣本總蛋白上樣量為60 μg進行電泳，加入預染蛋白Marker，將樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將目的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上；將膜經5% 脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，期間輕輕搖動，之后用TBST溶液清洗3次，每次10 min；將轉印膜放入雜交袋內，加入TBST稀釋一抗(Six1 1∶70， TGF-β 1∶50，VEGF-C 1∶50稀釋) ，封口，4 ℃ 靜置過夜。 用TBST 洗膜3 次，每次5 min，將膜放入雜交袋內，加入HRP-山羊抗兔IgG(TBST 1∶1 000稀釋) ，封口，室溫反應1 h，取出轉印膜，TBST 洗膜3 次，每次10 min，進行ECL顯色反應，檢測各條帶光密度值。

1.4免疫組織化學結果判斷采用雙評分半定量法進行綜合評分，高倍視野下根據細胞染色強度和陽性細胞所占比例綜合判定。染色強度評分標準為：不著色記 0 分，黃色記 1 分，棕黃色記 2 分，棕褐色記 3分。陽性細胞所占比例評定標準：陽性細胞率小于25%記 0 分，25%～50%記 1 分，51%～75%記 2 分，>75%記 3 分。兩種評分相加得出綜合得分，0～1分結果為陰性(-)，2 分結果為弱陽性(+)，3～4 分結果為陽性(++)，5～6 分結果為強陽性(+++)。

1.5統計學處理采用SPSS13.0統計軟件進行分析，根據數據特征進行卡方檢驗；用Spearman等級相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1Six1、TGF-β、VEGF-C蛋白在人喉鱗癌中的表達免疫組織化學檢測結果顯示：96例喉癌組織標本中，Six1、TGF-β、VEGF-C的陽性表達率分別為84.4%(81/96)、89.6%(86/96)和91.7%(88/96)，見圖1。

2.2Six1、TGF-β、VEGF-C蛋白在人喉鱗癌及癌旁正常黏膜中的表達免疫組織化學及Western blot檢測結果顯示：喉癌組織中Six1、TGF-β蛋白表達明顯高于癌旁正常喉黏膜，見表1，圖2。

圖1　　人喉鱗癌組織中Six1、TGF-β、VEGF-C的表達 (SP，×200)

組織nSix1TGF-βVEGF-C喉鱗癌9681(84.4)86(89.6)88(91.7)癌旁黏膜322(6.3)3(9.4)9(28.1)χ264.25789.76652.798P0.0000.0000.000

A:人喉鱗癌中蛋白表達;B:癌旁正常黏膜中蛋白表達。

圖1Western blot檢測人喉鱗癌及癌旁正常黏膜中蛋白表達

2.3Six1、TGF-β、VEGF-C蛋白表達與喉鱗癌患者臨床病理特征的關系喉鱗癌組織中Six1的陽性表達率在有淋巴結轉移的患者中高于無淋巴結轉移的患者(P<0.05)，同時Six1在中低分化患者中的陽性表達率高于其在高分化患者中的表達(P<0.05)；喉鱗癌組織中TGF-β的陽性表達率在有淋巴結轉移的患者中高于無淋巴結轉移的患者(P<0.05)；喉鱗癌組織中VEGF-C的陽性表達率在有淋巴結轉移的患者中高于無淋巴結轉移的患者(P<0.05)。同時VEGF-C在中低分化患者中的陽性表達率高于其在高分化患者中的表達(P<0.05)。見表2。

2.4喉鱗癌患者腫瘤組織中Six1、TGF-β、VEGF-C表達相關性Spearman等級相關性分析結果顯示，喉鱗癌患者腫瘤組織中Six1與TGF-β的表達無明顯相關性；TGF-β與VEGF-C表達無明顯相關性。Six1與VEGF-C表達呈正相關(P<0.05)。

表2　　Six1、TGF-β和VEGF-C的表達與喉鱗癌患者臨床病理學特征的關系

3　討　　論

喉鱗癌是耳鼻咽喉-頭頸外科的常見惡性腫瘤，復發和轉移是喉癌死亡率居高不下的主要原因，淋巴轉移是喉鱗癌最主要的轉移方式。腫瘤新生淋巴管的生成同腫瘤的轉移密切相關，同新生血管形成相似，腫瘤新生淋巴管生成有賴于腫瘤微環境各種因子的共同作用，在眾多因素之中，VEGF-C被認為是腫瘤新生淋巴管生成的最重要因素之一。VEGF-C是近年來發現的具有促進新生淋巴管生成作用的VEGF 家族新成員，又稱淋巴管生長因子，VEGF-C是一種分泌多肽，可由血管內皮細胞、淋巴管內皮細胞、腫瘤細胞及其間質細胞產生，通過自分泌或者旁分泌方式發揮生物學作用[3]。VEGFR-3主要存在于淋巴管內皮細胞，是VEGF-C 的特異性受體。研究表明，VEGF-C 能夠通過其特異性受體VEGFR-3 介導腫瘤新生淋巴管生成，在淋巴結轉移中起著重要的作用[4]。

TGF-β是一種具有多種生物學功能的細胞因子，相對分子質量約為25×103的同源二聚體。目前研究發現，在哺乳動物中存在3 種TGF-β的異構體:TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGFβ1 是含量最豐富，表達最多的亞型。TGF-β1主要通過以下3種方式發揮其生物活性，Smad 通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinases，MAPK)途徑及Wnt通路。TGF-β1有促進血管生成，誘導免疫抑制及促進腫瘤細胞的侵襲和轉移等多種生物學功能。尤其在腫瘤發生、發展的進程中，起到了促進腫瘤血管生成、細胞浸潤、轉移以及免疫抑制的作用[5]。研究表明，TGF-β1在胃癌、肺癌、乳腺癌、口腔癌等多種腫瘤組織中呈現高表達，其表達與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移、預后密切相關[6-7]。

Six1基因編碼產物屬于復合同源異型蛋白家族一員，是一個轉錄調節蛋白,調節著其下游很多基因的表達,包括編碼Cyclin D1、Cyclin A1和Ezrin等一系列能夠調節細胞增殖、生存與運動的基因[8]。Six1在多種組織生長、發育過程中起著極其重要的作用，其在多種非腫瘤性成熟組織中僅有少量表達，而在惡性腫瘤組織中常表現為過表達。研究表明，Six在乳腺癌、卵巢癌、肝細胞癌中表達明顯增強，并且同腫瘤的不良預后密切相關[9-10]。

本研究結果顯示，Six1、TGF-β及VEGF-C 3種蛋白在人喉鱗癌組織中均出現了陽性表達，尤其是Six1、TGF-β蛋白表達同癌周正常黏膜相比出現了明顯的增強，提示Six1、TGF-β及VEGF-C同喉鱗癌的發生、發展密切相關。同時研究結果顯示，在有淋巴結轉移組中Six1、TGF-β及VEGF-C蛋白的陽性表達率明顯升高，同無淋巴結轉移組相比差異有統計學意義，提示Six1、TGF-β及VEGF-C的高表達可能是促進喉鱗癌淋巴結轉移的重要因素。

研究結果顯示，Six1陽性表達率在低分化鱗癌患者中較高，同時，VEGF-C陽性表達率在低分化的鱗癌患者中也出現了升高，同高分化的鱗癌患者相比，差異均有統計學意義，相關性研究結果顯示，Six1的表達與VEGF-C表達呈正相關，即低分化鱗癌中VEGF-C表達的升高，同Six1表達增強有關。有研究結果顯示[11]，Six1能夠通過增強TGF-β途徑而變相刺激VEGF-C的表達，進一步促進腫瘤淋巴管的生成及淋巴結的轉移[11-14]。推測人喉鱗癌中高表達的Six1通過TGF-β途徑增強了VEGF-C的表達，進一步促進了喉鱗癌的淋巴結轉移，但其在人喉鱗狀細胞癌中具體的作用機制，及其與TGF-β的關系尚待進一步研究。

本文對Six1、TGF-β及VEGF-C在喉鱗癌淋巴管生成及轉移中的作用做了初步探討，結果提示，Six1/TGF可能成為抑制喉鱗癌淋巴管生成及轉移的潛在治療靶點。

[1]Zhao T,Zhao W,Meng W,et al.VEGF-C/VEGFR-3 pathway promotes myocyte hypertrophy and survival in the infarcted myocardium[J].Am J Transl Res,2015,7(4):697-709.

[2]Liu D,Li L,Zhang XX,et al.Six1 promotes tumor lymphangiogenesis by coordinating TGF beta signals that increase expression of VEGF-C[J].Cancer Res,2014,74(19):5597-5607.

[3]Zhu H,Yun F,Shi X,et al.VEGF-C inhibition reverses resistance of bladder cancer cells to cisplatin via upregulating maspin[J].Mol Med Rep,2015,12(2):3163-3169.

[4]Ishii H,Chikamatsu K,Sakakura K,et al.Primary tumor induces sentinel lymph node lymphangiogenesis in oral squamous cell carcinoma[J].Oral Oncol,2010,46(5):373-378.

[5]夏現印，王秀梅．轉化生長因子-β1在腫瘤中的研究進展[J]．現代腫瘤醫學，2014，22(3)：710-713．

[6]馬建波，戴金華，余秋云，等．非小細胞肺癌患者血清TGF-β1檢測水平的臨床研究[J]．中國衛生檢驗雜志，2010，20(6)：1456-1457．

[7]Shukla SK,Khatoon J,Prasad KN,et al.Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) modulates Epstein-Barr virus reactivation in absence of helicobacter pylori infection in patients with gastric cancer[J].Cytokine,2015,4666(15):30033-30038.

[8]李曉勇，劉少平．結直腸癌患者血清TGF-β1的檢測及臨床意義[J]．廣西醫科大學學報，2011，28(1)：82-84．

[9]Jo E,Park SJ,Choi YS,et al.Kaempferol suppresses transforming growth factor-β1-induced epithelial-to-Mesenchymal transition and migration of a549 lung cancer cells by inhibiting Akt1-mediated phosphorylation of Smad3 at threonine-179[J].Neoplasia,2015,17(7):525-537.

[10]Zhang L,Huang H,Huang YZ,et al.Expression and clinical significance of TGF-β1 and Smad4 in colorectal carcinoma[J].Youjiang Med J,2010,38(1):10-11.

[11]金愛花，金海燕．Six1蛋白在惡性腫瘤中的研究進展[J]．臨床與實驗病理學雜志，2014，30(4)：437-439,440．

[12]Jin HD,Cui MH,Kong JN,et al.Sineoculis homeobox homolog 1 protein is associated with breast cancer progression and survival outcome[J].Exp Mol Pathol,2014,97(2):247-252.

[13]Kong JN,Zhou XC,Liu SS,et al.Overexpression of sineoculis homeobox homolog 1 predicts poor prognosis of hepatocellular carcinoma[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(6):3018-3027.

[14]Micalizzi DS,Wang CA,Farabaugh SM,et al.Homeoprotein Six1 increases TGF-beta type I receptor and converts TGF-beta signaling from suppressive to supportive for tumor growth[J].Cancer Res,2010,70(24):10371-10380.

Expression of Six1,TGF-β and VEGF-C in patients with laryngeal squamous cell carcinoma and their correlation analysis

ZhangJihua，XuWenxia,WangLai,ZuJinmei△

(DepartmentofOtorhinolaryngology,FirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050031,China)

ObjectiveTo detect the expressions of Six1,TGF-β and their common induced VEGF-C in human laryngeal squamous cell carcinoma,and to explore their significance in the occurrence,development,metastasis and prognosis of laryngeal squamous cell carcinoma. MethodsThe clinical data and preserved paraffin samples of 96 patients with laryngeal squamous cell carcinoma confirmed by postoperative pathology were collected.The protein expression of Six1,TGF-β and VEGF-C was determined by adopting immunohistochemistry and Western blotting.ResultsThe positive expression rates of Six1,TGF-β and VEGF-C in the laryngel squamous cell carcinoma tissue samples were 84.4%(81/96),89.6%(86/96)and 91.7%(88/96)respectively.The positive expression rate of Six1 was significantly higher in the patients with poor differentiation and lymph node metastasis;the positive expression rate of TGF-β was significantly higher in the patients with lymph node metastasis and had no relationship with the degree of differentiation;the positive expression rate of VEGF-C was significantly higher in the patients with poor differentiation and lymph node metastasis;there was a positive correlation between expression of Six1 and VEGF-C in the laryngel squamous cell cancer tissue.ConclusionThe high expression of Six1,TGF-β and VEGF-C may promote lymphatic metastasis of laryngeal squamous cell carcinoma.Six1 expression may be one of the important influencing factors of the expression change of VEGF-C.The combined detection of Six1,TGF-β and VEGF-C has an important clinical significance for judging the metastasis and prognosis of LSCC.

Six1;TGF-β;VEGF-C;laryngeal neoplasms;lymphatic metastasis

張繼華(1978-)，主治醫師，碩士，主要從事頭頸腫瘤及鼾癥的研究。△

，E-mail:ZJMei@126.com。

R739.65

A

1671-8348(2016)20-2789-03

2015-12-25

2016-03-08)

論著·臨床研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.017