Fas/FasL在原發(fā)免疫性血小板減少癥發(fā)病機制中的作用研究*

陳　燕,邢宏運,李曉明,吳鵬強,馬　濤,陳　梅

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,四川瀘州 646000)

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Fas/FasL在原發(fā)免疫性血小板減少癥發(fā)病機制中的作用研究*

陳燕,邢宏運△,李曉明,吳鵬強,馬濤,陳梅

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科,四川瀘州 646000)

目的探討Fas及FasL系統(tǒng)在成年原發(fā)免疫性血小板減少癥(ITP)發(fā)病機制中的作用。方法收集成年初診ITP患者及健康成年人外周抗凝靜脈血。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測ITP患者Th/Tc、Th1/Th2、Tc1/Tc2細(xì)胞Fas及FasL的表達率、血小板表面Fas及FasL的表達率。結(jié)果與健康對照組相比，ITP組Th、Th1、Th2、Tc、Tc1、Tc2細(xì)胞表面Fas及FasL的表達率均明顯升高(P<0.05)；同時ITP組血小板表面Fas的表達率明顯升高(P<0.05)，而血小板表面FasL的表達無明顯變化(P>0.05)。結(jié)論ITP患者T細(xì)胞亞群及血小板表面Fas及FasL表達的異常，可能與ITP發(fā)病機制密切相關(guān)。

血小板減少；Fas/FasL系統(tǒng)；T細(xì)胞亞群；血小板

目前，關(guān)于原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)發(fā)病機制的研究越來越多，以往研究證實ITP的發(fā)病機制主要與體液免疫異常相關(guān)，即自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞增多。但近年來，多數(shù)研究表明細(xì)胞免疫因素在ITP的發(fā)病機制中也起著重要作用。本試驗以初診成年ITP患者及健康成年人外周血T淋巴細(xì)胞亞群和血小板為研究對象，檢測其表面Fas及FasL蛋白的表達情況，進一步探討細(xì)胞免疫在ITP的發(fā)病機制中的作用，從而為ITP的臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料研究對象分為ITP組及對照組，ITP組25例，均符合成人初診ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，取自西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，其中女13例，男12例，中位年齡45歲；對照組25例，取自西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院門診健康體檢者，其中女15例，男10例，中位年齡49.5歲；ITP組及對照組經(jīng)患者知情同意后，取外周靜脈血，肝素抗凝備測。

1.2試劑與儀器PE標(biāo)記的anti-CRTH2 mAb、CY5標(biāo)記的anti-CD4、CD8mAb以及小鼠抗人IgG1為Biolegend公司產(chǎn)品，ECD標(biāo)記的anti-CD3及PC7標(biāo)記的anti-CD45 mAb為Beckman Coulter公司產(chǎn)品，F(xiàn)ITC標(biāo)記的anti-Fas、FasLmAb及APC標(biāo)記的anti-CD42b mAb為BD公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國NAVIDS Beckman Coulter。

1.3方法

1.3.1外周血T細(xì)胞亞群及其表面Fas及FasL蛋白表達率的測定取外周靜脈血200 μL，加入溶血劑溶解紅細(xì)胞得到白細(xì)胞懸液；設(shè)置空白對照管(ISO)及檢測管(A、B、C、D)，各管加入相應(yīng)抗體各5 μL，ISO：anti-IgG1-ECD、anti-IgG1-PE、anti-IgG1-CY5、anti-IgG1-FITC、anti-CD45-PC7；A: anti-CD3-ECD、anti-CRTH2-PE、anti-CD4-CY5、anti-Fas-FITC、anti-CD45-PC7；B: anti-CD3-ECD、anti-CRTH2-PE、anti-CD4-CY5、anti-FasL-FITC、anti-CD45-PC7；C: anti-CD3-ECD、anti-CRTH2-PE、anti-CD8-CY5、anti-Fas-FITC、anti-CD45-PC7；D: anti-CD3-ECD、anti-CRTH2-PE、anti-CD8-CY5、anti-FasL-FITC、anti-CD45-PC7；空白對照管及檢測管各加入白細(xì)胞懸液50 μL，避光反應(yīng)15 min后加入PBS緩沖液上流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.2血小板表面Fas及FasL表達率的檢測設(shè)置空白對照管(ISO)及檢測管(A、B)，各管加入相應(yīng)抗體各5 μL，ISO：anti-IgG1-FITC、anti-CD42b-APC；A:anti-Fas-FITC 、anti-CD42b-APC；B:anti-FasL-FITC 、anti-CD42b-APC；ISO管及檢測管各加入全血5 μL；避光反應(yīng)25 min后加入PBS緩沖液上流式細(xì)胞儀檢測。

表1　　T淋巴細(xì)胞亞群中Fas蛋白的表達情況比較±s，%)

*：P<0.05，與對照組比較。

表2　　T淋巴細(xì)胞亞群表面FasL蛋白的表達情況比較±s，%)

*：P<0.05，與對照組比較。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS20.0進行統(tǒng)計分析，兩樣本均數(shù)滿足正態(tài)性和方差齊性，采用兩獨立樣本的t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1T細(xì)胞亞群(Th、Th1、Th2、Tc、Tc1、Tc2)表面Fas/FasL的表達情況與對照組相比，ITP組T細(xì)胞亞群表面Fas蛋白的表達率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。與對照組相比，ITP組T亞群表面FasL蛋白的表達率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。流式細(xì)胞檢測結(jié)果分析，以淋巴細(xì)胞群為研究對象，分別以Th1細(xì)胞(CD3+CD4+CRTH2-)及Th2細(xì)胞(CD3+CD4+CRTH2+)、Tc1細(xì)胞(CD3+CD8+CRTH2-)、Tc2細(xì)胞(CD3+CD8+CRTH2+)射門，檢測其表面Fas/FasL的表達情況如圖1～8所示。

圖1 Th1細(xì)胞表面Fas的表達率圖2 Th1細(xì)胞表面FasL的表達率圖3 Th2細(xì)胞表面Fas的表達率圖4 Th2細(xì)胞表面FasL的表達率

圖5 Tc1細(xì)胞表面Fas的表達率圖6 Tc1細(xì)胞表面FasL的表達率圖7 Tc2細(xì)胞表面Fas的表達率圖8 Tc2細(xì)胞表面FasL的表達率

2.2外周血血小板表面Fas及FasL蛋白的表達率與對照組相比，ITP組血小板表面Fas蛋白的表達率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而FasL蛋白的表達率無明顯變化，見表3。流式細(xì)胞檢測結(jié)果分析，根據(jù)FSC、SSC及CD42b確定血小板群， ITP組血小板表面Fas及FasL蛋白的表達情況如圖9～10所示。

表3　　血小板表面Fas及FasL蛋白的表達率比較

*：P<0.05，與對照組比較。

圖9　　ITP組血小板表面Fas的表達率

圖10　　ITP組血小板表面FasL蛋白的表達率

3　討　　論

Shenoy等[2]收集了20例伴有Fas基因突變的血液系統(tǒng)慢性自身免疫性疾病的兒童患者，研究其淋巴細(xì)胞凋亡情況，最終證實血液系統(tǒng)自身免疫性疾病的發(fā)生與Fas信號通路的改變密切相關(guān)。而后，Sedger等[3]發(fā)現(xiàn)致命性的自身免疫性血小板減少癥可發(fā)生于FASL和TRAIL雙敲除小鼠，提示ITP的發(fā)生與FAS/FASL信號通路密不可分。同時，不少研究[4-5]通過不同方法檢測了ITP患者血清中游離狀態(tài)sFas、sFasL的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其明顯高于健康人。這些研究認(rèn)為ITP患者血清中高水平的sFas及sFasL將導(dǎo)致 Fas及FasL蛋白的封閉，從而導(dǎo)致免疫下調(diào)機制失效，B淋巴細(xì)胞的凋亡減少，進一步導(dǎo)致抗體的持續(xù)產(chǎn)生，血小板的破壞增加。以上研究結(jié)果均證實ITP的發(fā)病機制與Fas/FasL信號同路密切相關(guān)。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了成年初診ITP患者及健康成年人外周血T細(xì)胞亞群表面Fas及FasL蛋白的表達率，結(jié)果顯示：(1)與對照組相比，ITP組T細(xì)胞亞群表面Fas及FasL蛋白的表達均是明顯升高的；(2)Tc細(xì)胞表面以FasL蛋白升高水平更為明顯；(3)Th細(xì)胞表面以Fas蛋白升高更為明顯。因此，筆者認(rèn)為：ITP組Th細(xì)胞Fas及FasL表達失衡，F(xiàn)as/FasL信號通路異常，導(dǎo)致Th細(xì)胞的自我清除減少。一方面，ITP組Th細(xì)胞增多，主要是Th1類細(xì)胞增多，其釋放的細(xì)胞因子(γ-干擾素、白細(xì)胞介素-2、轉(zhuǎn)化生長因子-β)增多，進一步促進Th1、CTL及NK細(xì)胞的增殖和活化，加速患者體內(nèi)的血小板破壞；另一方面， Th細(xì)胞的增加，可進一步輔助B細(xì)胞產(chǎn)生血小板抗體，輔助Tc細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，最終導(dǎo)致血小板的破壞增加。此外，F(xiàn)asL主要表達于被激活的T細(xì)胞、NK細(xì)胞，其能夠誘發(fā)表達Fas的T細(xì)胞發(fā)生凋亡，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)參與了免疫應(yīng)答過程中淋巴細(xì)胞數(shù)量的調(diào)控[6]。本研究結(jié)果中Tc細(xì)胞以FasL蛋白增高更明顯，因此筆者認(rèn)為ITP組活化的Tc細(xì)胞Fas/FasL凋亡途徑發(fā)生異常，外周血中活化的Tc細(xì)胞增多，最終使血小板的破壞增加。

肖紅等[7]檢測了ITP患兒及健康兒童外周血T細(xì)胞(Th/Tc、Th1/Th2、Tc1/Tc2)及血小板表面Fas及FasL的表達情況，結(jié)果提示Th、Tc、Th1、Th2、Tc1、Tc2細(xì)胞Fas、FasL表達均明顯升高。此外Zhong等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，ITP組CD4+及CD8+T淋巴細(xì)胞FasL蛋白的表達都是明顯增高的。本研究結(jié)果與以上研究是基本一致的。高清平等[9]采用流式細(xì)胞儀檢測了健康對照組及慢性特發(fā)性血小板減少癥治療前后淋巴細(xì)胞及血小板表面Fas及FasL蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比， ITP患者T細(xì)胞表面Fas的表達明顯降低，F(xiàn)asL表達明顯升高，與本研究結(jié)果不完全一致，其原因可能是： 本研究主要以急性ITP為研究對象，而高清平等主要以慢性ITP為研究對象； 筆者采用了多標(biāo)記熒光檢測，而高清平等采用的是雙標(biāo)記熒光檢測法； 與患者個體差異及所收集標(biāo)本含量不同相關(guān)。

同時筆者采用流式細(xì)胞術(shù)，以全血法處理標(biāo)本，結(jié)合CD42b、FSC確定血小板群，檢測其表面Fas及FasL蛋白的表達率，結(jié)果顯示與肖紅等的研究結(jié)果一致，ITP組血小板表面Fas表達明顯升高，F(xiàn)asL表達無明顯變化。筆者認(rèn)為血小板表面Fas蛋白的表達增高，其可與活化的T淋巴細(xì)胞(即表達FasL的T淋巴細(xì)胞)結(jié)合，最終通過Fas/FasL信號通路促進血小板的凋亡。

綜上所述，本試驗結(jié)果表明，ITP患者T細(xì)胞亞群及血小板表面Fas、FasL的表達異常，在ITP細(xì)胞免疫功能紊亂、T細(xì)胞亞群及血小板的凋亡中起著重要作用，F(xiàn)as及FasL系統(tǒng)可能與ITP的細(xì)胞免疫病理機制密切相關(guān)。

[1]張之南．血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M]．2版．北京：科學(xué)出版社，1998．

[2]Shenoy S,Mohanakumar T,Chatila T,et al.Defective apoptosis in lymphocytes and the role of IL-2 in autoimmune hematologic cytopenias[J].Clin Immunol,2001,99(2):266-275.

[3]Sedger LM,KatewaA,Pettersen AK,et al.Extreme lymphoprolifertive disease and fatal autoimmune thrombocytopenia in FasL and TRAIL double-deficient mice[J].Blood,2010,115(16):3258-3268.

[4]Yoshimura C,Nomura S,Nagahama M,et al.Plasma-soluble Fas (APO-1,CD95) and soluble Fas ligand in immune thrombocytopenic purpura[J].Eur J Haematol,2000,64(4):219-224.

[5]Jin L,Stolpa JC,Young RM,et al.MHC class Ⅱ structural requirements for the association with Igalpha/beta,and signaling of Calcium mobilization and cell death[J].Immunol Lett,2008,116(2):184-194.

[6]Jia Rp ZX,clinical significance of CD4+CD25+Treg cells,sFas and sFasL in peripheral blood of patients with autoimmune thrombocytopenic purpura[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2011,19(5):1264-1267.

[7]肖紅，劉仿，伍昌林，等．特發(fā)性血小板減少性紫癜患兒外周血T細(xì)胞亞群及血小板凋亡相關(guān)蛋白表達的研究[J]．臨床血液學(xué)雜志，2007，20(5)：275-277．

[8]Zhong YG,Feng WY,Luo HQ,et al.Fas-FasL and caspase-3 signal transduction pathway and apoptosis of peripheral T lymphocytes in ITP patients[J].Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi,2008,29(5):329-332.

[9]高清平，黃望香，李秀珍．慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜淋巴細(xì)胞和血小板凋亡蛋白的表達[J]．臨床血液學(xué)雜志，2001，14(3)：104-106．

Study on role of Fas/FasL in pathogenesis of primary immune thrombocytopenia*

ChenYan,XingHongyun△,LiXiaoming,WuPengjiang,MaTao,ChenMei

(DepartmentofHematology,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo explore the role of Fas and FasL system in the pathogenesis of adult primary immune thrombocytopenic purpura (ITP).MethodsThe peripheral anticoagulant venous blood samples were collected from the patients with newly diagnosed ITP and healthy adults.The expression rates of Fas and FasL in Th/Tc,Th1/Th2,Tc1/Tc2 cells and their expression rates at platelet surface were detected by flow cytometry.ResultsThe Fas and FasL expression rates on the surface of Th,Th1,Th2,Tc,Tc1 and Tc2 in the ITP group were increased compared with the healthy control group(P<0.05).,meanwhile the FasL expression on the platelet surface was significantly increased(P<0.05),but the expression of FasL on the platelet surface had no obvious change(P>0.05).ConclusionThe Fas and FasL expression on T cell subsets and platelet surface in ITP patients is abnormal,which may be related with the pathogenesis of ITP.

thrombocytopenia；Fas/FasL system；T cell subsets；thrombocyte

四川省衛(wèi)生廳項目(110349)；瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院青年人才基金[(2011)43號]。作者簡介：陳燕(1986-),住院醫(yī)師，碩士，主要從事血液病診斷與治療方面的研究。△

，E-mail:xinghy52003@foxmail.com。

R558

A

1671-8348(2016)20-2795-03

2015-12-23

2016-03-06)

論著·臨床研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.019