Fas/FasL在原發免疫性血小板減少癥發病機制中的作用研究*

陳　燕,邢宏運,李曉明,吳鵬強,馬　濤,陳　梅

(西南醫科大學附屬醫院血液內科,四川瀘州 646000)

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Fas/FasL在原發免疫性血小板減少癥發病機制中的作用研究*

陳燕,邢宏運△,李曉明,吳鵬強,馬濤,陳梅

(西南醫科大學附屬醫院血液內科,四川瀘州 646000)

目的探討Fas及FasL系統在成年原發免疫性血小板減少癥(ITP)發病機制中的作用。方法收集成年初診ITP患者及健康成年人外周抗凝靜脈血。采用流式細胞術檢測ITP患者Th/Tc、Th1/Th2、Tc1/Tc2細胞Fas及FasL的表達率、血小板表面Fas及FasL的表達率。結果與健康對照組相比，ITP組Th、Th1、Th2、Tc、Tc1、Tc2細胞表面Fas及FasL的表達率均明顯升高(P<0.05)；同時ITP組血小板表面Fas的表達率明顯升高(P<0.05)，而血小板表面FasL的表達無明顯變化(P>0.05)。結論ITP患者T細胞亞群及血小板表面Fas及FasL表達的異常，可能與ITP發病機制密切相關。

血小板減少；Fas/FasL系統；T細胞亞群；血小板

目前，關于原發免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)發病機制的研究越來越多，以往研究證實ITP的發病機制主要與體液免疫異常相關，即自身抗體介導的血小板破壞增多。但近年來，多數研究表明細胞免疫因素在ITP的發病機制中也起著重要作用。本試驗以初診成年ITP患者及健康成年人外周血T淋巴細胞亞群和血小板為研究對象，檢測其表面Fas及FasL蛋白的表達情況，進一步探討細胞免疫在ITP的發病機制中的作用，從而為ITP的臨床診斷和治療提供理論依據。

1　資料與方法

1.1一般資料研究對象分為ITP組及對照組，ITP組25例，均符合成人初診ITP診斷標準[1]，取自西南醫科大學附屬醫院血液內科，其中女13例，男12例，中位年齡45歲；對照組25例，取自西南醫科大學附屬醫院門診健康體檢者，其中女15例，男10例，中位年齡49.5歲；ITP組及對照組經患者知情同意后，取外周靜脈血，肝素抗凝備測。

1.2試劑與儀器PE標記的anti-CRTH2 mAb、CY5標記的anti-CD4、CD8mAb以及小鼠抗人IgG1為Biolegend公司產品，ECD標記的anti-CD3及PC7標記的anti-CD45 mAb為Beckman Coulter公司產品，FITC標記的anti-Fas、FasLmAb及APC標記的anti-CD42b mAb為BD公司產品，流式細胞儀為美國NAVIDS Beckman Coulter。

1.3方法

1.3.1外周血T細胞亞群及其表面Fas及FasL蛋白表達率的測定取外周靜脈血200 μL，加入溶血劑溶解紅細胞得到白細胞懸液；設置空白對照管(ISO)及檢測管(A、B、C、D)，各管加入相應抗體各5 μL，ISO：anti-IgG1-ECD、anti-IgG1-PE、anti-IgG1-CY5、anti-IgG1-FITC、anti-CD45-PC7；A: anti-CD3-ECD、anti-CRTH2-PE、anti-CD4-CY5、anti-Fas-FITC、anti-CD45-PC7；B: anti-CD3-ECD、anti-CRTH2-PE、anti-CD4-CY5、anti-FasL-FITC、anti-CD45-PC7；C: anti-CD3-ECD、anti-CRTH2-PE、anti-CD8-CY5、anti-Fas-FITC、anti-CD45-PC7；D: anti-CD3-ECD、anti-CRTH2-PE、anti-CD8-CY5、anti-FasL-FITC、anti-CD45-PC7；空白對照管及檢測管各加入白細胞懸液50 μL，避光反應15 min后加入PBS緩沖液上流式細胞儀檢測。

1.3.2血小板表面Fas及FasL表達率的檢測設置空白對照管(ISO)及檢測管(A、B)，各管加入相應抗體各5 μL，ISO：anti-IgG1-FITC、anti-CD42b-APC；A:anti-Fas-FITC 、anti-CD42b-APC；B:anti-FasL-FITC 、anti-CD42b-APC；ISO管及檢測管各加入全血5 μL；避光反應25 min后加入PBS緩沖液上流式細胞儀檢測。

表1　　T淋巴細胞亞群中Fas蛋白的表達情況比較±s，%)

*：P<0.05，與對照組比較。

表2　　T淋巴細胞亞群表面FasL蛋白的表達情況比較±s，%)

*：P<0.05，與對照組比較。

1.4統計學處理采用SPSS20.0進行統計分析，兩樣本均數滿足正態性和方差齊性，采用兩獨立樣本的t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2　結　　果

2.1T細胞亞群(Th、Th1、Th2、Tc、Tc1、Tc2)表面Fas/FasL的表達情況與對照組相比，ITP組T細胞亞群表面Fas蛋白的表達率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。與對照組相比，ITP組T亞群表面FasL蛋白的表達率明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表2。流式細胞檢測結果分析，以淋巴細胞群為研究對象，分別以Th1細胞(CD3+CD4+CRTH2-)及Th2細胞(CD3+CD4+CRTH2+)、Tc1細胞(CD3+CD8+CRTH2-)、Tc2細胞(CD3+CD8+CRTH2+)射門，檢測其表面Fas/FasL的表達情況如圖1～8所示。

圖1 Th1細胞表面Fas的表達率圖2 Th1細胞表面FasL的表達率圖3 Th2細胞表面Fas的表達率圖4 Th2細胞表面FasL的表達率

圖5 Tc1細胞表面Fas的表達率圖6 Tc1細胞表面FasL的表達率圖7 Tc2細胞表面Fas的表達率圖8 Tc2細胞表面FasL的表達率

2.2外周血血小板表面Fas及FasL蛋白的表達率與對照組相比，ITP組血小板表面Fas蛋白的表達率明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，而FasL蛋白的表達率無明顯變化，見表3。流式細胞檢測結果分析，根據FSC、SSC及CD42b確定血小板群， ITP組血小板表面Fas及FasL蛋白的表達情況如圖9～10所示。

表3　　血小板表面Fas及FasL蛋白的表達率比較

*：P<0.05，與對照組比較。

圖9　　ITP組血小板表面Fas的表達率

圖10　　ITP組血小板表面FasL蛋白的表達率

3　討　　論

Shenoy等[2]收集了20例伴有Fas基因突變的血液系統慢性自身免疫性疾病的兒童患者，研究其淋巴細胞凋亡情況，最終證實血液系統自身免疫性疾病的發生與Fas信號通路的改變密切相關。而后，Sedger等[3]發現致命性的自身免疫性血小板減少癥可發生于FASL和TRAIL雙敲除小鼠，提示ITP的發生與FAS/FASL信號通路密不可分。同時，不少研究[4-5]通過不同方法檢測了ITP患者血清中游離狀態sFas、sFasL的水平，結果發現其明顯高于健康人。這些研究認為ITP患者血清中高水平的sFas及sFasL將導致 Fas及FasL蛋白的封閉，從而導致免疫下調機制失效，B淋巴細胞的凋亡減少，進一步導致抗體的持續產生，血小板的破壞增加。以上研究結果均證實ITP的發病機制與Fas/FasL信號同路密切相關。

本研究采用流式細胞術檢測了成年初診ITP患者及健康成年人外周血T細胞亞群表面Fas及FasL蛋白的表達率，結果顯示：(1)與對照組相比，ITP組T細胞亞群表面Fas及FasL蛋白的表達均是明顯升高的；(2)Tc細胞表面以FasL蛋白升高水平更為明顯；(3)Th細胞表面以Fas蛋白升高更為明顯。因此，筆者認為：ITP組Th細胞Fas及FasL表達失衡，Fas/FasL信號通路異常，導致Th細胞的自我清除減少。一方面，ITP組Th細胞增多，主要是Th1類細胞增多，其釋放的細胞因子(γ-干擾素、白細胞介素-2、轉化生長因子-β)增多，進一步促進Th1、CTL及NK細胞的增殖和活化，加速患者體內的血小板破壞；另一方面， Th細胞的增加，可進一步輔助B細胞產生血小板抗體，輔助Tc細胞的細胞毒性作用，最終導致血小板的破壞增加。此外，FasL主要表達于被激活的T細胞、NK細胞，其能夠誘發表達Fas的T細胞發生凋亡，Fas/FasL系統參與了免疫應答過程中淋巴細胞數量的調控[6]。本研究結果中Tc細胞以FasL蛋白增高更明顯，因此筆者認為ITP組活化的Tc細胞Fas/FasL凋亡途徑發生異常，外周血中活化的Tc細胞增多，最終使血小板的破壞增加。

肖紅等[7]檢測了ITP患兒及健康兒童外周血T細胞(Th/Tc、Th1/Th2、Tc1/Tc2)及血小板表面Fas及FasL的表達情況，結果提示Th、Tc、Th1、Th2、Tc1、Tc2細胞Fas、FasL表達均明顯升高。此外Zhong等[8]研究發現，與對照組相比，ITP組CD4+及CD8+T淋巴細胞FasL蛋白的表達都是明顯增高的。本研究結果與以上研究是基本一致的。高清平等[9]采用流式細胞儀檢測了健康對照組及慢性特發性血小板減少癥治療前后淋巴細胞及血小板表面Fas及FasL蛋白的表達，結果發現與健康對照組相比， ITP患者T細胞表面Fas的表達明顯降低，FasL表達明顯升高，與本研究結果不完全一致，其原因可能是： 本研究主要以急性ITP為研究對象，而高清平等主要以慢性ITP為研究對象； 筆者采用了多標記熒光檢測，而高清平等采用的是雙標記熒光檢測法； 與患者個體差異及所收集標本含量不同相關。

同時筆者采用流式細胞術，以全血法處理標本，結合CD42b、FSC確定血小板群，檢測其表面Fas及FasL蛋白的表達率，結果顯示與肖紅等的研究結果一致，ITP組血小板表面Fas表達明顯升高，FasL表達無明顯變化。筆者認為血小板表面Fas蛋白的表達增高，其可與活化的T淋巴細胞(即表達FasL的T淋巴細胞)結合，最終通過Fas/FasL信號通路促進血小板的凋亡。

綜上所述，本試驗結果表明，ITP患者T細胞亞群及血小板表面Fas、FasL的表達異常，在ITP細胞免疫功能紊亂、T細胞亞群及血小板的凋亡中起著重要作用，Fas及FasL系統可能與ITP的細胞免疫病理機制密切相關。

[1]張之南．血液病診斷及療效標準[M]．2版．北京：科學出版社，1998．

[2]Shenoy S,Mohanakumar T,Chatila T,et al.Defective apoptosis in lymphocytes and the role of IL-2 in autoimmune hematologic cytopenias[J].Clin Immunol,2001,99(2):266-275.

[3]Sedger LM,KatewaA,Pettersen AK,et al.Extreme lymphoprolifertive disease and fatal autoimmune thrombocytopenia in FasL and TRAIL double-deficient mice[J].Blood,2010,115(16):3258-3268.

[4]Yoshimura C,Nomura S,Nagahama M,et al.Plasma-soluble Fas (APO-1,CD95) and soluble Fas ligand in immune thrombocytopenic purpura[J].Eur J Haematol,2000,64(4):219-224.

[5]Jin L,Stolpa JC,Young RM,et al.MHC class Ⅱ structural requirements for the association with Igalpha/beta,and signaling of Calcium mobilization and cell death[J].Immunol Lett,2008,116(2):184-194.

[6]Jia Rp ZX,clinical significance of CD4+CD25+Treg cells,sFas and sFasL in peripheral blood of patients with autoimmune thrombocytopenic purpura[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi,2011,19(5):1264-1267.

[7]肖紅，劉仿，伍昌林，等．特發性血小板減少性紫癜患兒外周血T細胞亞群及血小板凋亡相關蛋白表達的研究[J]．臨床血液學雜志，2007，20(5)：275-277．

[8]Zhong YG,Feng WY,Luo HQ,et al.Fas-FasL and caspase-3 signal transduction pathway and apoptosis of peripheral T lymphocytes in ITP patients[J].Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi,2008,29(5):329-332.

[9]高清平，黃望香，李秀珍．慢性特發性血小板減少性紫癜淋巴細胞和血小板凋亡蛋白的表達[J]．臨床血液學雜志，2001，14(3)：104-106．

Study on role of Fas/FasL in pathogenesis of primary immune thrombocytopenia*

ChenYan,XingHongyun△,LiXiaoming,WuPengjiang,MaTao,ChenMei

(DepartmentofHematology,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo explore the role of Fas and FasL system in the pathogenesis of adult primary immune thrombocytopenic purpura (ITP).MethodsThe peripheral anticoagulant venous blood samples were collected from the patients with newly diagnosed ITP and healthy adults.The expression rates of Fas and FasL in Th/Tc,Th1/Th2,Tc1/Tc2 cells and their expression rates at platelet surface were detected by flow cytometry.ResultsThe Fas and FasL expression rates on the surface of Th,Th1,Th2,Tc,Tc1 and Tc2 in the ITP group were increased compared with the healthy control group(P<0.05).,meanwhile the FasL expression on the platelet surface was significantly increased(P<0.05),but the expression of FasL on the platelet surface had no obvious change(P>0.05).ConclusionThe Fas and FasL expression on T cell subsets and platelet surface in ITP patients is abnormal,which may be related with the pathogenesis of ITP.

thrombocytopenia；Fas/FasL system；T cell subsets；thrombocyte

四川省衛生廳項目(110349)；瀘州醫學院附屬醫院青年人才基金[(2011)43號]。作者簡介：陳燕(1986-),住院醫師，碩士，主要從事血液病診斷與治療方面的研究。△

，E-mail:xinghy52003@foxmail.com。

R558

A

1671-8348(2016)20-2795-03

2015-12-23

2016-03-06)

論著·臨床研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.019