肺炎克雷伯菌分離株的耐藥性與毒力基因分布及相互關系研究*

趙瑞珂，李艷萌，2，顧國浩，韓清珍，趙麗娜，錢雪峰，張險峰，史進方，徐　杰△

(1.蘇州大學附屬第一醫院檢驗科　215006；2.山東省日照市人民醫院檢驗科　276826)

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肺炎克雷伯菌分離株的耐藥性與毒力基因分布及相互關系研究*

趙瑞珂1，李艷萌1，2，顧國浩1，韓清珍1，趙麗娜1，錢雪峰1，張險峰1，史進方1，徐杰1△

(1.蘇州大學附屬第一醫院檢驗科215006；2.山東省日照市人民醫院檢驗科276826)

目的研究肺炎克雷伯菌的耐藥性與毒力基因的分布及二者間的關系，為臨床合理使用抗菌藥物和控制感染提供依據。方法分離出172株肺炎克雷伯菌，采用紙片擴散法(K-B法)做藥物敏感試驗；聚合酶鏈反應(PCR)檢測rmpA、aer-1、aer-2、magA、gyrB-2、ybt、wcaG毒力基因。結果172株肺炎克雷伯菌分離株對頭孢菌素類頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢噻肟與頭孢曲松的耐藥率分別為38.4%、34.9%、33.1%、32.0%。rmpA、aer-1、aer-2、magA、gyrB-2、ybt、wcaG毒力基因的陽性率分別為49.4%、55.8%、42.4%、16.3%、51.7%、53.5%、20.9%。肺炎克雷伯菌毒力基因分布與耐藥性呈負相關，差異有統計學意義(P<0.01)。結論肺炎克雷伯菌毒力基因數與耐藥性密切相關，臨床應注意抗菌藥物的合理應用，防止肺炎克雷伯菌耐藥性的產生和傳播。

肺炎克雷伯菌；毒力基因；耐藥性

肺炎克雷伯菌是醫院感染常見的細菌，主要引起免疫力低下患者的各種感染，如原發性肺炎，存在于人體上呼吸道和腸道，當機體抵抗力降低時，便經呼吸道進入肺內而引起大葉或小葉融合性實變，造成肺炎[1]。產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)是肺炎克雷伯菌對多種抗菌藥物耐藥的重要原因。ESBLs基因多有質粒介導，而這些質粒常同時攜帶氨基糖苷鈍化酶、ampC酶、喹諾酮類等藥物的耐藥基因，表現出多重耐藥、交叉耐藥。近年來隨著廣譜抗菌藥物的不規范使用，多重耐藥的肺炎克雷伯菌檢出率不斷上升，這給臨床的治療帶來了很大的難題。

為了解肺炎克雷伯菌的耐藥性與致病性及二者間的關系，本研究對臨床分離的172株肺炎克雷伯菌進行耐藥性與毒力基因的分析，了解其耐藥譜和毒力基因分布，并分析二者間的關系，為臨床由肺炎克雷伯菌引起感染的治療提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源選擇2013年10月至2014年9月蘇州大學附屬第一醫院住院患者分離出的肺炎克雷伯菌，共172株。同一患者同類標本同一時期分離到的同種菌株不重復計入。質控菌株：大腸埃希菌ATCC25922。

1.1.2鑒定與藥敏分離出的細菌均經法國Bio-Merieux公司VITEK Ⅱ Compact鑒定，保存于-70 ℃。有效期內用于抗菌藥物體外敏感試驗的藥物敏感試驗紙片：復方磺胺、氨芐青霉素、慶大霉素、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、丁胺卡那、環丙沙星、亞胺培南，均購自英國Oxoid公司。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗采用紙片擴散法(K-B法)進行藥敏試驗，結果參照2011版美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)標準，對172株肺炎克雷伯菌分離株進行藥物敏感性判定。產ESBLs肺炎克雷伯菌用聚合酶鏈反應(PCR)法檢測SHV、TEM、CTX-M、OXAs基因確定。將耐一種抗菌藥物的簡稱為“耐藥模式一”，耐兩種抗菌藥物的簡稱為“耐藥模式二”，以此類推分析172株菌株的耐藥模式。

1.2.2DNA模板的制備水煮法制備DNA模板，99 ℃煮10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為PCR模板，-20 ℃放置備用。

1.2.3PCR反應體系及條件反應體系為25 μL：2.5 μL的10× PCR buffer、1 U的Taq聚合酶、0.5 μL的上下游引物(20 μM)、2 μL的DNA基因組模板，ddH2O定容至25 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s、50～57 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30個循環；72℃ 延伸10 min；4 ℃ forever。根據參考文獻[1]設計rmpA、aer-1、aer-2、magA、gyrB-2、ybt、wcaG基因的引物，引物均由華大基因有限公司合成。120 V恒壓瓊脂糖凝膠電泳，PCR產物根據條帶長度進行判定。

1.3統計學處理應用SPSS 21.0進行統計分析，菌株耐藥統計分析時設定為“1”，敏感設定為“0”；毒力基因有為“1”，無為“0”， ESBLs組與非ESBLs組比較均值做獨立樣本t檢驗。利用SPSS 21.0軟件雙變量相關性分析，對分離株的多種藥耐藥率和毒力基因數關系進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1肺炎克雷伯菌對15種常見抗菌藥物藥敏檢測結果頭孢菌素類頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢噻肟與頭孢曲松的耐藥率依次為38.4%、34.9%、33.1%、32.0%。頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、亞胺培南的耐藥率非常低(<15%)，見表1。肺炎克雷伯菌多重耐藥模式分析發現，耐3種以上抗菌藥物的百分率為37.2%，而且其多重耐藥譜主要集中于青霉素類、頭孢類、氟喹諾酮類為基礎的不同組合。全敏感菌株和“耐藥模式一”的構成比為55.8%，這說明大部分菌株對15種抗菌藥物較為敏感，見表2。

2.2肺炎克雷伯菌分離株毒力基因分布比較分析毒力基因在172株肺炎克雷伯菌株中的分布，結果顯示，毒力基因rmpA、aer-1、aer-2、magA、gyrB-2、ybt、wcaG的陽性率分別為49.4%、55.8%、42.4%、16.3%、51.7%、53.5%、20.9%。ESBLs與非ESBLs肺炎克雷伯菌株間毒力基因檢出率差異有統計學意義(P<0.05)。毒力基因在172株肺炎克雷伯菌中分布見表2。另外，172株肺炎克雷伯菌中含有一種毒力基因或多種毒力基因，其分布構成比見表3。

2.3毒力基因分布與耐藥性之間的關系毒力基因數與耐藥性間的相關系數為-0.521，呈負相關，在P=0.01水平(雙側)上顯著相關。也就是說，毒力基因分布數越多的菌株，多重耐藥現象出現的概率就越小。

表1　　172株肺炎克雷伯菌分離株的耐藥率[n(%)]

表2　　172株肺炎克雷伯菌不同毒力基因的分布率[n(%)]

表3　　肺炎克雷伯菌中毒力基因構成比[n(%)]

3　討　　論

隨著高級別頭孢類抗菌藥物的大量使用，肺炎克雷伯菌對其耐藥率在逐年上升，這可能與其產ESBLs耐藥機制有關。本研究對172株肺炎克雷伯菌臨床分離株進行多重耐藥譜分析發現，耐3種及以上抗菌藥物的多重耐藥率達可達37.2%，而且其多重耐藥譜主要集中于哌拉西林(青霉素類)、頭孢類、慶大霉素、環丙沙星(氟喹諾酮類)等為基礎的不同組合。全敏感菌株和“耐藥模式一”的構成比為55.8%，這說明大部分菌株對15種抗菌藥物較為敏感，可見肺炎克雷伯菌的耐藥并未出現大腸埃希菌的多重耐藥現象。

肺炎克雷伯菌是呼吸道感染的重要條件致病菌，常引起社區獲得性肺炎或醫院內感染肺炎。肺炎克雷伯菌具有一些重要的毒力基因，其編碼蛋白在肺炎克雷伯菌與宿主間的侵襲、黏附、定植、抗吞噬等環節發揮重要作用，例如莢膜抗原、菌毛、抗血清殺菌活性和脂多糖、含鐵細胞相關的基因。magA基因編碼一種外膜蛋白，它參與肺炎克雷伯菌的保護性表多糖網絡的形成，并且其表達可致原發性肝膿腫以及轉移性的膿毒性并發癥[2]，而rmpA基因被180-kb質粒編碼，它的表達控制著類黏蛋白的表型以及莢膜黏多糖的產生，這正是肺炎克雷伯菌能在體內外試驗中保持抗吞噬能力的關鍵[3-4]。magA、rmpA基因的表達與高黏液表型形成密切相關[5]。Ybt可以使細菌菌體在呼吸道定植并通過規避Lcn2引起肺炎，亦是肺炎克雷伯菌的一個重要的致病因子[6]。Holt等[7]對300株肺炎克雷伯菌的全基因組測序和泛基因組數據分析研究發現，引起社區侵襲性感染的肺炎克雷伯菌與特定的毒力基因譜有關；與非侵襲性感染和攜帶的肺炎克雷伯菌相比，侵襲性肺炎克雷伯菌有rmpA、rmpA2和鐵攝取基因簇顯著相關。本研究結果顯示，肺炎克雷伯菌rmpA、aer-1、gyrB、ybt基因檢出率非常高，肺炎克雷伯菌臨床分離株攜帶多種毒力因子，通過其功能發揮引起相關感染。

毒力與耐藥是細菌兩個重要致病性因素，在感染中發揮重要作用。本研究毒力基因分布數與耐藥性相關分析發現，毒力基因數與耐藥性之間呈顯著負相關，越是耐藥的菌株，其攜帶的毒力基因個數越少；越是敏感的菌株，其攜帶的毒力基因個數越多。毒力基因數與耐藥性間呈負相關與本研究對尿路致病性大腸埃希菌毒力與耐藥性的研究結果相一致[8]；同時Shin等[9]的研究結論也和本研究結果相一致，即藥敏越敏感的菌株其致病性越強。Shin等[9]對產CTX-M和非ESBLs的肺炎克雷伯菌基因型和毒力特征比較分析發現，產CTX-M和非ESBLs的肺炎克雷伯菌沒有發生耐藥質粒從耐藥菌株往敏感菌株轉移的現象；產CTX-M和非ESBLs的肺炎克雷伯菌的ST基因型不同，CTX-M某一基因型在醫院獲得性感染中占優勢更傾向于用某一ST型的暴發來解釋，因此控制多重耐藥產ESBLs肺炎克雷伯菌的傳播對于醫院感染控制工作尤為重要。本研究中毒力基因數與耐藥性負相關的結果表明，毒力的獲得與丟失和耐藥性的獲得與丟失間存在一定的關系。但是，有關毒力與耐藥之間的作用關系，還有待進一步深入探討。

綜上所述，肺炎克雷伯菌分離株對大多常見抗菌藥物表現為敏感，產ESBLs酶的菌株僅占24.4%，但臨床要重點關注與監測頭孢類抗菌藥物使用選擇壓力下肺炎克雷伯菌獲得攜帶ESBLs基因的相關質粒，及耐藥性產生、變遷與抗菌藥物使用變化間的關系。肺炎克雷伯菌分離株中存在大量與細菌莢膜形成、脂多糖合成、黏液型、抗吞噬、鐵獲取相關的毒力基因，如magA、rmpA、aerA、ybt基因。因此，醫院要關注和加強肺炎克雷伯菌的耐藥與毒力基因攜帶情況的監測，規范合理使用抗菌藥物，防止耐藥菌株的產生和傳播。

[1]Lin WH,Wang MC,Tseng CC,et al.Clinical and microbiological characteristics of Klebsiella pneumoniae isolates causing community-acquired urinary tract infections[J].Infection,2010,38(6):459-464.

[2]Fang CT,Chuang YP,Shun CT,et al.A novel virulence gene in Klebsiella pneumoniae strains causing primary liver abscess and septic metastatic complications[J].J Exp Med,2004,199(5):697-705.

[3]Yu WL,Ko WC,Cheng KC,et al.Association between rmpA and magA genes and clinical syndromes caused by Klebsiella pneumoniae in Taiwan[J].Clin Infect Dis,2006,42(10):1351-1358.

[4]Nassif X,Fournier J,Arondel J,et al.Mucoid phenotype of Klebsiella pneumoniae is a plasmid-encoded virulence factor[J].Infection and immunity,1989,57(2):546-552.

[5]Lin JC,Siu LK,Fung CP,et al.Impaired phagocytosis of capsular serotypes K1 or K2 Klebsiella pneumoniae in type 2 diabetes mellitus patients with poor glycemic control[J].J Clin Endocrinol Metab,2006,91(8):3084-3087.

[6]Hunt JJ,Wang JT,Callegan MC.Contribution of mucoviscosity-associated gene A (magA) to virulence in experimental Klebsiella pneumoniae endophthalmitis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2011,52(9):6860-6866.

[7]Holt KE,Wertheim H,Zadoks RN,et al.Genomic analysis of diversity,population structure,virulence,and antimicrobial resistance in Klebsiella pneumoniae,an urgent threat to public health[J].Proceed Nation Academy Sci,2015,112(27):E3574-E3581.

[8]劉世巍,徐杰,張正芳,等.尿路感染 ESBLs 陽性大腸埃希菌的基因分型與耐藥性分析[J].現代檢驗醫學雜志,2012,27(4):5-8.

[9]Shin J,Ko KS.Comparative study of genotype and virulence in CTX-M-producing and non-extended-spectrum-β-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae isolates[J].Antimicrob Agents Chemother,2014,58(4):2463-2467.

江蘇省衛生廳醫學科研項目(Q201401)；江蘇省研究生培養創新工程項目(KYLX-1261)；蘇州市“科教興衛”青年課題項目(kjxw2014008)。作者簡介：趙瑞珂(1986-)，在讀碩士，主要從事臨床細菌耐藥與致病機制研究。△

，E-mail:xuj2007@lzu.edu.cn。

R978.1

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1671-8348(2016)20-2820-04

2016-02-18

2016-04-09)

·經驗交流·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.027