HIF-1α和Rac1在宮頸鱗狀細胞癌中的表達及意義*

陳　瑛，敖啟林，黃　磊，寧　楊，李　莉，王玉蘭，李　瑞，田　訓，李賀梅，張慶華△

(1.華中科技大學附屬武漢中心醫院婦產科，武漢 430014；2.華中科技大學附屬同濟醫院病理科，武漢 430000)

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HIF-1α和Rac1在宮頸鱗狀細胞癌中的表達及意義*

陳瑛1，敖啟林2，黃磊1，寧楊1，李莉1，王玉蘭1，李瑞1，田訓1，李賀梅1，張慶華1△

(1.華中科技大學附屬武漢中心醫院婦產科，武漢 430014；2.華中科技大學附屬同濟醫院病理科，武漢 430000)

目的探討缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)和Ras相關C3肉毒桿菌毒素底物1(Rac1)在宮頸上皮內瘤變(CIN)和鱗狀細胞癌中的表達以及臨床意義。方法采用免疫組織化學法檢測正常宮頸組織20例、宮頸CIN 42例(CINⅠ級12例，CINⅡ～Ⅲ級30例)、宮頸鱗狀細胞癌58例(高分化15例，中分化24例，低分化19例)中HIF-1α和Rac1蛋白的表達情況，以分析其表達與臨床病理特征的關系，并結合臨床資料進行分析。結果HIF-1α蛋白在正常宮頸黏膜組織中的陽性表達率為0%(0/20)，CINⅠ級組織陽性表達率為16.7%(2/12)，CINⅡ～Ⅲ級組織陽性表達率為56.7%(17/30)，宮頸鱗狀細胞癌組織陽性表達率為81.0%(47/58)，其中高分化陽性表達率53.3%，中分化陽性表達率83.3%，低分化陽性表達率100%。HIF-1α蛋白在宮頸鱗狀細胞癌發生發展中的表達依次升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。且宮頸鱗狀細胞癌組織中HIF-1α蛋白表達與其組織學分級、TNM分期及淋巴結轉移有關(P<0.05)。Rac1蛋白表達在正常宮頸黏膜組織中的陽性表達率為0%(0/20)，宮頸CINⅠ級組織陽性表達率為8.3%(1/12)，宮頸CINⅡ～Ⅲ級組織陽性表達率為53.3%(16/30)，宮頸鱗狀細胞癌組織陽性表達率為77.6%(45/58)，其中高分化陽性表達率60.0%，中分化陽性表達率73.0%，低分化陽性表達率94.7%。Rac1蛋白在宮頸癌發生發展中的表達依次升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。且宮頸鱗狀細胞癌組織Rac1蛋白表達與其組織學分級、TNM分期及淋巴結轉移有關(P<0.05)。HIF-1α蛋白的陽性表達率與Rac1蛋白的陽性表達率呈正相關(r=0.3，P<0.05)。結論HIF-1α及Rac1聯合檢測蛋白表達有助于判斷宮頸鱗狀上皮腫瘤的病變程度及預后。

宮頸鱗狀細胞癌；缺氧誘導因子-1α；Ras相關C3肉毒桿菌毒素底物1

宮頸癌是全球女性最常見的婦科惡性實體腫瘤，嚴重威脅女性健康。我國每年新增宮頸癌病例約13.5萬，占全球發病數量的1/3。缺氧是惡性實體瘤的基本特征之一，在缺氧環境中處于核心地位的缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是一種異源二聚體蛋白復合物，由α和β兩個蛋白亞基組成，HIF-1α在動物及人體的多種腫瘤組織中呈過度表達，促進血管形成，維持腫瘤細胞的能量代謝,影響腫瘤的生長、轉移和凋亡[1]。Ras 相關 C3 肉毒桿菌毒素底物 1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)是小G蛋白Rho家族的重要成員，在腫瘤組織中激活狀態的Rac1通過參與細胞骨架重組、基因轉錄調控和細胞信號轉導等生理過程[2]，影響腫瘤細胞的極性、黏附、生長和運動能力，而且越來越多的證據顯示Rac1能被缺氧激活[3]，在誘導HIF-1α轉錄活性增強過程中發揮關鍵作用[4]。

本研究擬對HIF-1α、Rac1蛋白在各種程度宮頸鱗狀細胞病變中的表達及其相關性進行研究，探索其與臨床病理參數的關系，為探討新的宮頸癌診斷和治療靶點提供理論依據。

1　資料與方法

1.1一般資料收集武漢市中心醫院2009年7月至2011年6月手術切除的宮頸組織共120例，其中子宮良性病變患者手術切除后的正常宮頸組織20例、宮頸上皮內瘤變(CIN)42例(CINⅠ級12例、CINⅡ和Ⅲ級30例)、宮頸鱗狀細胞癌58例，患者平均年齡49.2歲，58例宮頸鱗狀細胞癌患者術前均未接受放療、化療。組織學分級根據世界衛生組織2003年腫瘤細胞分化程度分類標準：低分化癌19例，中分化癌24例，高分化癌15例。TNM分期根據FIGO 2000年修訂的標準：Ⅰ期22例，Ⅱ期24例，Ⅲ期8例，Ⅳ期4例，無淋巴結轉移者37例，有淋巴結轉移者21例。上述所有病例的診斷均經1～2位有豐富臨床病理診斷經驗的高級職稱病理醫師證實。

1.2試劑鼠抗人HIF-1α單克隆抗體為Neomarker公司產品，鼠抗人Rac1 單克隆抗體為美國Santa Cruz公司產品，SP免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒、二甲苯、乙醇、PBS緩沖液pH7.4，乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液pH9.0、過氧化氫、蘇木素、1%鹽酸酒精等。

1.3免疫組織化學檢測上述組織標本均置于10%甲醛溶液固定，經脫水、透明、浸蠟、包埋后4 μm連續切片，進行HE染色和免疫組織化學染色。鼠抗人HIF-1α單克隆抗體工作濃度為1∶50，鼠抗人Rac1單克隆抗體工作濃度為1∶50，梯度乙醇(100%、95%、80%、70%)。

1.4免疫組織化學結果判斷HIF-1α和Rac1的結果判定標準:HIF-1α的陽性表達為細胞核或胞質被染成淺黃色、棕黃色或黃褐色顆粒。Rac1蛋白陽性表達主要位于腫瘤細胞的細胞質中，呈淺黃色或深黃色。

按染色強度計分:無染色計0分,輕度染色計1分,中度染色計2分,強染色計3分;按陽性染色細胞百分率計分:陽性細胞數小于或等于10%計0分,陽性細胞數>10%～25%計1分,陽性細胞數>25%～50%計2分,陽性細胞數大于50%計3分。然后將兩類計分結果的乘積得分分為以下等級:0分為-,1～2分為+,3～4分為++,5～6分為+++。設定+～+++為陽性表達,-為陰性表達。

1.5統計學處理所有數據用SPSS13.0統計學軟件進行處理，應用χ2檢驗分析HIF-1α和Rac1在各宮頸組織中的表達，應用Spearman等級相關性分析進行HIF-1α和Rac1的相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結　　果

2.1HIF-1α及Rac1在正常宮頸組織、宮頸CIN組織和宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達HIF-1α及Rac1其在各組宮頸病變中表達情況見表1和圖1。HIF-1α及Rac1在正常宮頸組織中無表達，HIF-1α在CINⅠ級、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸鱗狀細胞癌中的陽性表達率(16.7%、56.7%、81.0%)，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2HIF-1α及Rac1與宮頸鱗狀細胞癌的組織學分級、分期及淋巴轉移的關系在不同臨床分期的宮頸鱗狀細胞癌中,HIF-1α在Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的陽性表達率(78.3%vs. 91.7%)差異有統計學意義(P<0.05)；Rac1在Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的陽性表達率(73.9%vs. 91.7%)差異有統計學意義(P<0.05)，隨期別的進展而升高(表2)。

圖1　　HIF-1α及Rac1在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達(SP×100)

組別nHIF-1α陰性陽性陽性率(%)PRac1陰性陽性陽性率(%)P正常宮頸組織202000<0.052000<0.05CINⅠ1210216.71118.3CINⅡ～Ⅲ30131756.7141653.3宮頸鱗狀細胞癌組織58114781.0134577.6

表2　　HIF-1α和Rac1蛋白表達與宮頸鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系

Rac1在CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸鱗狀細胞癌的陽性表達率(8.3%、53.3%、77.6%)，差異有統計學意義(P<0.05)。在不同組織學分化程度的宮頸鱗狀細胞癌中,HIF-1α在低分化組、中分化組、高分化組的陽性表達率(100.0%、83.3%、53.3%)差異有統計學意義(P<0.05)， Rac1在低分化組、中分化組、高分化組的陽性表達率(94.7%、75.0%、60.0%)，差異有統計學意義(P<0.05)。58例宮頸鱗狀細胞癌患者中，有淋巴結轉移者的HIF-1α及Rac1陽性表達率均高于無淋巴結轉移者。

2.3在宮頸CIN組織和宮頸鱗狀細胞癌組織中HIF-1α和Rac1表達的相關性42例宮頸CIN組織中，Rac1和HIF-1α蛋白共同表達陽性14例，共同表達陰性20例，采用Spearman等級相關性分析，Rac1和HIF-1α蛋白的表達呈正相關(r=0.3,P<0.05)見表3。

表3　　宮頸CIN組織中HIF-1α和Rac1蛋白表達的關系(n)

58例宮頸鱗狀細胞癌組織中，Rac1和HIF-1α蛋白共同表達陽性40例，共同表達陰性6例，采用Spearman等級相關性分析，Rac1和HIF-1α蛋白的表達呈正相關(r=0.3，P<0.05)，見表4。

表4　　宮頸鱗狀細胞癌組織中HIF-1α和Rac1蛋白表達的關系(n)

3　討　　論

HIF-1α盡管在正常氧濃度下也表達,但很快可被泛素蛋白酶體系統所降解;而在缺氧狀態時其降解過程被阻斷,導致HIF-1α在核內蓄積,與β蛋白亞基結合，形成有活性的HIF-1,啟動多種下游基因[5],使細胞適應缺氧狀態，促進腫瘤細胞的生長和分裂，而且可通過減少有氧代謝中反應性氧類對細胞 DNA 復制的破壞，促進腫瘤的增殖和轉移。

大量免疫組織化學實驗已證明，HIF-1α 在人類多種腫瘤中表達增加，HIF-1α通過調節不同靶基因的轉錄活性及其自身的表達，參與腫瘤的增殖凋亡與侵襲轉移等過程，其過度表達與惡性腫瘤的不良預后有關[6]。本實驗研究結果也顯示：HIF-1α蛋白在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達遠高于宮頸CIN組織及正常子宮頸組織，且宮頸鱗狀細胞癌組織HIF-1α表達與浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期相關，說明HIF-1α蛋白高表達的宮頸鱗狀細胞癌具有更強的侵襲能力，提示HIF-1α其過度表達可能與宮頸癌不良預后有關，對其表達程度的檢測具有重要的生物學和臨床價值。

Rac-1 基因位于人染色體7p22，有Rac1、Rac2、Rac3 3個亞型。Rac1蛋白可廣泛表達于機體各組織中，通過結合或水解GTP 核苷酸，在GDP 結合形式( 失活狀態)與 GTP 結合形式( 激活狀態) 之間相互轉換[7]。腫瘤組織中活性形式的Rac1蛋白參與調節細胞絲狀偽足的生成以及膜皺縮[7-9],調節腫瘤細胞的運動，影響腫瘤的生長。此外，Rac1還通過增加細胞內超氧化物陰離子，抑制腫瘤細胞發生凋亡[10]，對腫瘤的發展及侵襲轉移起著重要的作用。

目前大多數試驗表明Rac1與人類惡性腫瘤的發生發展有著密切的關系，在多種惡性腫瘤中呈過表達，Rac1在腫瘤及其增殖、轉移過程中起著重要作用[11]。本試驗研究結果表明在宮頸鱗狀細胞癌組織中Rac1的表達高于宮頸CIN組織，且與浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期相關。宮頸CIN組織中高級別病變的Rac1表達高于低級別病變，高于正常宮頸組織。

近年來有研究發現在某些惡性腫瘤中存在HIF-1α和Rac1蛋白共同表達的情況， Rac1通過抑制VHL蛋白水平可在低氧環境中增加HIF-1α的穩定性,進一步促進腫瘤血管的生成[12]。此外Rac1是HIF-1α的上游調控基因，Rac1可通過結合蛋白激酶調節缺氧引起的HIF-1及HIF-1 相關蛋白的磷酸化和氧化還原反應，從而參與HIF-1α的活化，促進其表達[13]。Rac1通過激活p38MAPK 活化HIF-1α末端活性區(TAD),從而提高了HIF-1的轉錄活性。DU等[14]研究發現Rac1在人類乳腺癌中能激活促進HIF-1α的表達。本研究分析顯示， HIF-1α與Rac1的表達在宮頸癌前病變及宮頸鱗狀細胞癌中呈正相關(r=0.3,P<0.05),且隨宮頸病變的進展而變化的趨勢也基本一致，提示HIF-1α與Rac1可能有著較密切的聯系。

綜上所述,HIF-1α和Rac1在宮頸癌前病變及宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達水平均明顯增高，浸潤深度越深，分化程度越低，表達水平越高。且在宮頸鱗狀細胞癌組織中二者的表達呈正相關，提示在宮頸鱗狀細胞癌的病理演變過程中，HIF-1α與Rac1相互間可能存在協同調控作用，促進了宮頸癌的進展及轉移。分析二者協同作用的機制可能為腫瘤組織中Rac1通過激活p38MAPK活化HIF-1α末端活性區(TAD)，提高了HIF-1α的轉錄活性[4]，且通過抑制VHL蛋白水平在低氧狀態下增加了HIF-1α的穩定性[15]。

總之，HIF-1α及Rac1的聯合檢測有助于判斷宮頸上皮內瘤變的病變程度，評價宮頸鱗狀細胞癌的生物學行為和預后，為其早期診斷和治療提供理論依據。

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武漢市衛生局臨床醫學科研項目資助(WX11B05)。作者簡介：陳瑛(1979-)，主治醫師，碩士，主要從事婦科腫瘤方面的研究。△

，E-mail:zhangqh66@qq.com。

R711.74

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1671-8348(2016)20-2828-04

2016-02-11

2016-04-18)

·經驗交流·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.030