山木瓜枝中抑制黃嘌呤氧化酶活性的化學成分研究

唐躍勛　祝倫倫　張　洪　譚紅勝　付文衛

(1 上海中醫藥大學中藥學院，上海，201203； 2 中藥創新藥物研發上海高校工程研究中心，上海，201203)

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山木瓜枝中抑制黃嘌呤氧化酶活性的化學成分研究

唐躍勛1,2祝倫倫1,2張洪1,2譚紅勝1,2付文衛1,2

(1 上海中醫藥大學中藥學院，上海，201203； 2 中藥創新藥物研發上海高校工程研究中心，上海，201203)

目的：研究山木瓜枝中抑制黃嘌呤氧化酶活性的化學成分。方法：通過活性導向分離，篩選山木瓜枝中具有抑制黃嘌呤氧化酶活性的粗提物及組分，采用多種色譜分離技術對活性部位進行系統分離，通過理化常數和光譜分析，結合相關文獻確定所得化合物的結構；并對所得化合物進行黃嘌呤氧化酶抑制活性的研究。結果：從山木瓜枝的乙酸乙酯部位分離得到6個化合物，經鑒定分別為桑橙素(1)、4,6,3′,4′-tetrahydroxy-2-methoxybenzophenone(2)、2,4,6,3′-tetrahydroxybenzo-phenone(3)、3,6,7-trihydroxy-1-methoxyxanthone(4)、2S,3S-3,5,7,3′,5′-pentahydroxyavane(5)、丁香酸(6)；實驗研究證實化合物1對黃嘌呤氧化酶具有一定的抑制活性(IC50=28.9 μM)。結論：從活性部位鑒定的6個化合物均為首次從該植物中分離得到，其中化合物1是主要的活性成分。

山木瓜；化學成分；黃嘌呤氧化酶抑制活性；桑橙素

痛風是一種嘌呤代謝紊亂，尿酸產生過多或因尿酸排泄不良而導致血中尿酸升高，尿酸鹽結晶沉積在關節滑膜、滑囊、軟骨及其他組織，從而引起的反復發作性的炎性疾病。其臨床特點為高尿酸血癥。目前常用的治療痛風和高尿酸血癥的藥物主要是黃嘌呤氧化酶(XOD)抑制劑。臨床上最常用的黃嘌呤氧化酶抑制劑是別嘌呤醇[1]。然而由于嚴重的不良反應，該藥的使用受到了限制[2]，因此尋找新的、作用顯著的、不良反應小的黃嘌呤氧化酶抑制劑顯得極為重要且迫切。另外，黃嘌呤氧化酶會對某些疾病造成影響，包括缺血再灌注損傷、心肌梗死、高血壓、動脈粥樣硬化等[3]。所以尋找新的黃嘌呤氧化酶抑制劑不僅是抗痛風的需要，同時也會對治療其他某些疾病產生積極的影響。

藤黃屬植物共有450余種，其中我國分布22種。本課題組對多種藤黃屬植物的提取物進行了較為系統的黃嘌呤氧化酶活性抑制篩選，結果顯示山木瓜枝80%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位具有較強的抑制黃嘌呤氧化酶活性。乙酸乙酯萃取部位經MCI柱色譜分離得到的30%，60%和90%乙醇洗脫部位(M1～M3)均顯示了一定的黃嘌呤氧化酶抑制活性。課題組前期對60%乙醇洗脫部位(M2)進行了較為系統的化學成分研究，從中分離得到多個具有黃嘌呤氧化酶活性抑制活性的成分[4]。為進一步探索山木瓜枝條中具有抑制黃嘌呤氧化酶活性的成分，筆者對30%乙醇洗脫部位(M1)進行了系統的化學成分研究，從中分離得到6個化合物。通過理化性質、光譜分析，結合相關文獻，這些化合物分別被鑒定為桑橙素(1)、4,6,3′,4′-tetrahydroxy-2-methoxybenzophenone(2)、2,4,6,3′-tetrahydroxy-benzophenone(3)、3,6,7-trihydroxy-1-methoxyxanthone(4)、2S,3S-3,5,7,3′,5′-pentahydroxyavane(5)和丁香酸(6)，實驗證實化合物1對黃嘌呤氧化酶具有一定的抑制活性(IC50=28.9 μM)。本次研究發現和鑒定的6個化合物均首次從該植物中分離得到。

1　材料與儀器

1.1藥材山木瓜枝，于2010年8月采自云南省怒江市，經云南中醫學院周元川教授鑒定為藤黃屬植物山木瓜(G.esculentaY.H.Li.)，標本存放于上海中醫藥大學中藥創新藥物研發上海高校工程研究中心(編號:No.20100801)。

1.2藥品與試劑黃嘌呤氧化酶(批號：No.27093203，Oriental Yeast公司)；別嘌呤(Tokyo Chemical Industry公司)；黃嘌呤(批號：No.TGG4402，Wako Pure Chemical Industries公司)；DMSO(Sigma-Aldrich公司)；其他所有化學藥品、鹽酸、PBS等均購于國藥集團。別嘌呤及受試化合物純度高于98%。

1.3儀器與填料核磁共振波譜儀用Bruker AV-400型核磁共振波譜儀(TMS為內標)；ESI-MS和HR-ESI-Q-TOF-MS分別用Agilent 6210 ESI-TOF和Agilent 6520 ESI-Q-TOF質譜儀；高效液相色譜儀采用Waters 2535高效液相色譜儀(色譜柱采用Xbridge C18column; 4.6 mm×250 mm，5 μm)；薄層色譜硅膠板和柱色譜硅膠均為青島海洋化工廠生產；凝膠Sephadex LH-20為GE Healthcare BioSciences AB；反相C18柱(50 μm，YMC)。

2　方法

2.1山木瓜枝不同極性提取物和M1組分的制備山木瓜枝不同極性提取物S1～S4由石油醚、乙酸乙酯和水等不同極性溶劑制備得到。制備方法如下[4]：干燥的山木瓜枝4 kg，粉碎后用石油醚提取得石油醚提取部位(S1)，藥渣繼續用體積分數80%的乙醇回流提取，濾液減壓濃縮至浸膏。浸膏加水懸浮后用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取部位(S2)和水萃取部位(S3)，藥渣繼續用蒸餾水回流提取得水提部位(S4)。其中S2經MCI柱色譜，經30%乙醇洗脫，得到30%乙醇洗脫部位M1。

2.2山木瓜枝不同極性提取物及M1組分抑制黃嘌呤氧化酶活性試驗[5]

2.2.1溶液的配制緩沖溶液配制：精密稱取KH2PO40.478 0 g，K2HPO4·3H2O 3.473 0 g，加入純凈水約240 mL，定容至250 mL即得含75 mmol·L-1磷酸根離子，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)。

底物的配制：精密稱取黃嘌呤適量，加入PBS，定容，配成黃嘌呤濃度為150 μM的底物溶液，底物溶液新鮮配制，現配現用。

酶液配制：取黃嘌呤氧化酶適量，加入PBS，定容，配成0.1U的黃嘌呤氧化酶溶液。

供試藥物的配制：精密稱取適量供試品，用適量二甲基亞砜(DMSO)溶解，于-20 ℃避光保存。用時用PBS稀釋至所需濃度。DMSO含量低于5%。

2.2.2山木瓜枝不同極性提取物S1～S4和M1組分抑制黃嘌呤氧化酶活性試驗本試驗采用別嘌呤作為陽性對照，將供試樣品溶液、陽性對照溶液及空白溶液(空白為PBS)各50 μL、酶液30 μL、PBS 70 μL依次加入96孔板，37 ℃孵育15 min后，加入底物60 μL啟動反應，在295 nm處，每隔15s讀數1次，記錄吸光度A，共計3 min。每組平行設置兩個復孔。抑制率(%)可通過樣品組及空白組A值的變化，用下列公式計算：抑制率(%)=(1-A樣品/A空白)/100。取兩個復孔的平均值即為樣品的抑制率。

2.3提取和分離30%乙醇部位(M1，6 g)經硅膠柱色譜，用二氯甲烷-甲醇(v/v，30∶1→1∶1)梯度洗脫，得到F1～F4共4個組分。F1組分經Sephadex LH-20甲醇純化，得到化合物2(8 mg)；F2組分經Sephadex LH-20甲醇純化，得到化合物3(15 mg)；F3組分經Sephadex LH-20甲醇分離，TLC薄層制備(v/v，CH2Cl2:MeOH=10∶1)得到化合物1(17 mg)，4(3 mg)，5(6 mg)；F4組分經HPLC制備(v/v，CH3CN∶H2O=42∶58)得到化合物6(7 mg)。

2.4化合物1～6對黃嘌呤氧化酶抑制活性的評價方法同2.2.2，測試分離所得的6個化合物體外抑制黃嘌呤氧化酶活性。

3　結果

3.1結構鑒定化合物1：黃色粉末，分子式C13H10O6。1H NMR(CD3OD，600MHz)δH：5.88(s，2H，H-3，H-5)、6.77(1H，d，J=8.3 Hz，H-5′)、7.15(1H，dd，J=8.3，2.0 Hz，H-6′)、7.21(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′);13C NMR(CD3OD，150MHz)δC：95.9(C-3，C-5)、107.2(C-1)、115.5(C-5′)、117.6(C-2′)、124.1(C-6′)、133.8(C-1′)、145.8(C-3′)、151.2(C-4′)、161.9(C-2，C-6)、164.0(C-4)、199.1(C-7)。上述數據與文獻[6]報道的桑橙素(Maclurin)數據基本一致，鑒定化合物1為桑橙素。

化合物2：黃色粉末，分子式C14H12O6。1H NMR(DMSO-d6，600MHz)δH：3.54(3H，s，2-OCH3)、5.95(1H，d，J=1.6 Hz，H-3)、5.99(1H，d，J=1.6 Hz，H-5)、6.75(1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)、7.03(1H，dd，J=8.2，1.9 Hz，H-6′)、7.14(1H，d，J=1.9 Hz，H-2′);13C NMR(DMSO-d6，150MHz)δC：55.2(2-OCH3)、90.7(C-3)、95.4(C-5)、108.3(C-1)、156.2(C-6)、158.4(C-2)、159.4(C-4)、193.3(C-7)、130.4(C-1′)、116.2(C-2′)、144.8(C-3′)、150.4(C-4′)、115.0(C-5′)、122.1(C-6′)。上述數據與文獻[7]報道的4,6,3′,4′-tetrahydroxy-2-methoxybenzophenone數據基本一致，鑒定化合物2為4,6,3′,4′-tetrahydroxy-2-methoxybenzophenone。

化合物3：黃色粉末，分子式C13H10O5。1H NMR(CD3OD，600MHz)δH：5.86(s，2H，H1-3，H1-5)、6.90(1H，dd，J=8.0，1.8 Hz，H-6′)、7.03-6.98(1H，m，H-2′)、7.06(1H，d，J=7.7 Hz，H-4′)，7.20(1H，t，J=7.8 Hz，H-5′);13C NMR(CD3OD，150MHz)δC：95.9(C-3，C-5)、106.3(C-1)、116.1(C-5′)、119.3(C-2′)、129.9(C-6′)、144.3(C-1′)、158.2(C-3′)、120.7(C-4′)、163.7(C-2，C-6)、165.8(C-4)、200.7(C-7)。上述數據與文獻[8]報道的2,4,6,3′-tetrahydroxybenzophenone數據基本一致，鑒定化合物3為2,4,6,3′-tetrahydroxybenzophenone。

化合物4：黃色粉末，分子式C14H10O6。1H NMR(CD3OD，600MHz)δH：3.80(3H，s，1-OCH3)、6.23(1H，s，H-2)、6.26(1H，s，H-4)、6.59(1H，s，H-5)、7.35(1H，s，H-8)。13C NMR(CD3OD，150MHz)δC：56.4(1-OCH3)、161.3(C-1)、96.6(C-2)、165.2(C-3)、96.8(C-4)、102.8(C-5)、157.0(C-6)、145.3(C-7)、109.2(C-8)、163.3(C-4a)、152.5(C-4b)、115.0(C-8a)、105.9(C-9a)、177.0(C-9)。上述數據與文獻[9]報道的3,6,7-trihydroxy-1-methoxyxanthone數據基本一致，鑒定化合物4為3,6,7-trihydroxy-1-methoxyxanthone。

化合物5:黃色粉末，分子式C15H14O6。1H NMR(CD3OD，600MHz)δH：2.45(1H，m，H-4a)、2.67(1H，dd，J=16.3，4.4 Hz，H-4b)、4.00(1H，d，J=3.3 Hz，H-3)、4.73(1H，s，H-2)、5.72(1H，d，J=2.2 Hz，H-8)、5.90(1H，d，J=2.2 Hz，H-6)、6.65(1H，d，J=1.6 Hz，H-2′)、6.66(1H，s，H-6′)、6.89(1H，d，J=1.4 Hz，H-6′)。13C NMR(CD3OD，150MHz)δC：28.2(C-4)、64.9(C-3)、78.1(C-2)、155.8(C-5)、95.1(C-6)、156.6(C-7)、94.1(C-8)、156.3(C-9)、98.5(C-10)、130.6(C-1′)、114.8(C-2′)、144.5(C-3′)、118.0(C-4′)、144.5(C-5′)、114.9(C-6′)。上述數據與文獻[10]報道的2S,3S-3,5,7,3′,5′-pentahydroxyavane數據基本一致，鑒定化合物5為2S,3S-3,5,7,3′,5′-pentahydroxyavane。

化合物6：白色粉末，分子式C9H10O5。1H NMR(CD3OD，600MHz)δH：7.33(2H，s，H1-2，H1-6)、3.88(6H，s，3-OCH3，5-OCH3);13C NMR(CD3OD，150MHz)δC：170.1(C-7)、147.3(C-3，5)、139.7(C-4)、123.1(C-1)、106.9(C-2，6)、55.4(C-3-OCH3，5-OCH3)。上述數據與文獻[11]報道的丁香酸的波譜數據基本一致，鑒定化合物6為丁香酸(syringic acid)。

圖1　化合物1-6的結構式

圖2　提取物S1～S4抑制黃嘌呤氧化酶活性

表1　提取物S2、組分M1及桑橙素(1)抑制黃嘌呤氧化酶活性的IC50(n=3)

3.2山木瓜枝不同極性提取物S1～S4、組分M1以及分離所得化合物1～6抑制黃嘌呤氧化酶活性實驗結果提取物S2、組分M1以及化合物1具有較強的抑制黃嘌呤氧化酶活性，其IC50如表1及圖2所示。

4　討論

本研究通過活性導向分離，從山木瓜枝中具有黃嘌呤氧化酶抑制活性的30%乙醇洗脫部位分離得到6個化合物。這些化合物均首次從該植物中分離得到，其中桑橙素(1)具有一定的黃嘌呤氧化酶抑制活性。化合物1、2、3具有相似的結構。化合物1和化合物2的區別在于化合物1的2位由酚羥基取代，而化合物2的2位由甲氧基取代，化合物1具有黃嘌呤氧化酶抑制活性，而化合物2無活性，推斷化合物1的2位羥基與黃嘌呤氧化酶的抑制活性密切相關；化合物1和化合物3的區別在于化合物1比化合物3多了4′位酚羥基，化合物3沒有抑制黃嘌呤氧化酶活性，推斷化合物1的4′位酚羥基也可能與黃嘌呤氧化酶的抑制活性密切相關。

本研究首次報道桑橙素具有抑制黃嘌呤氧化酶活性。桑橙素最早于1975年從藤黃屬植物山竹中分離得到。研究表明桑橙素具有抗布氏錐蟲[12]、抗寄生原生動物[13]及抗氧化活性[6]。桑橙素是一類二苯甲酮類衍生物，V.Lakshmi Ranganatha等[14]合成的一類具有二苯甲酮結構片段的噻唑烷類化合物具有顯著的抑制黃嘌呤氧化酶活性，提示二苯甲酮類化合物在抑制黃嘌呤氧化酶活性方面的潛在應用。

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(2016-07-05收稿責任編輯：洪志強)

Xanthine Oxidase Inhibitors from The Twigs of Garcinia Esculenta

Tang Yuexun1,2，Zhu Lunlun1,2，Zhang Hong1,2，Tan Hongsheng1,2，Fu Wenwei1,2

(1SchoolofPharmacy，ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai201203，China; 2EngineeringResearchCenterofShanghaiCollegesforTCMNewDrugDiscovery，Shanghai201203，China)

Objective:To study the xanthine oxidase inhibitors from the twigs of Garcinia esculenta，and identify novel xanthine oxidase inhibitors.Methods:Bioassay-guided fractionation was used in the investigation of the extracts from the twigs of Garcinia esculenta，as well as means of column chromatography.The structures of the isolated compounds in the investigation were elucidated by comprehensive NMR and MS spectroscopic data analysis，as well as compared with previously publications.The effects of the isolated compounds on xanthine oxidase have been further investigated.Results:Six compounds were isolated from EtOAc fraction of the twigs of Garcinia esculenta，and their structures were identified to be maclurin(1)，4,6,3′,4′-tetrahydroxy-2-methoxybenzophenone(2)，2,4,6,3′-tetrahydroxybenzophenone(3)，3,6,7-trihydroxy-1-methoxyxanthone(4)，2S,3S-3,5,7,3′,5′-pentahydroxyavane(5)，syringic acid(6).Compound 1 showed moderate inhibition on xanthine oxidase activity with an IC50value of approximately 28.9 μM.Conclusion:Compounds 1-6 were isolated from the plant，and the xanthine oxidase inhibitory effect of compound 1 was reported for the first time.

Garcinia esculenta; Chemical Constituents; Xanthine Oxidase Inhibition; Maclurin

國家自然科學基金項目(編號：81173485，81303188，81303266)；上海自然基金青年基金(編號：13ZR1462000)；2013年度上海晨光計劃(編號：13CG46)

唐躍勛(1990.05—)，男，碩士研究生，研究方向：中藥活性成分研究，E-mail：tangyuexun90@126.com

付文衛(1970.09—)，男，博士，副研究員，研究方向：中藥活性成分研究，E-mail：fu_wenwei@163.com

R284

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.003