正交設計法優選忍冬藤中綠原酸提取工藝

毛　瑩　李東霞　夏春麗

(大連大學醫學院，大連，116622)

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正交設計法優選忍冬藤中綠原酸提取工藝

毛瑩李東霞夏春麗

(大連大學醫學院，大連，116622)

目的：對忍冬藤中綠原酸的提取工藝進行研究。方法：采用正交設計法設計忍冬藤中綠原酸的微波提取工藝和超聲波提取工藝，采用高效液相法測定各提取工藝下的綠原酸含量，并將兩種提取方法得到的結果進行比較。結果：微波提取法的最佳提取工藝為：微波時間為60 s，乙醇濃度為50%，料液比為1∶15，綠原酸含量為0.357%。超聲波法最佳提取工藝為：提取功率為50 Hz，甲醇濃度為50%，料液比為1∶20，綠原酸含量為0.321%。以綠原酸含量為指標，微波提取法優于超聲波提取法。結論：忍冬藤中綠原酸的最佳提取方法為微波提取法，此方法時間短，耗能低，提取率優于超聲波提取法，可用于忍冬藤中綠原酸的提取。

忍冬藤；綠原酸；正交設計；提取方法；含量測定

忍冬藤為忍冬科植物忍冬(LonicerajaponicaThunb.)的干燥莖枝，具有清熱解毒、疏風通絡之功效。綠原酸是忍冬藤的主要有效成分之一[1-2]，現代研究表明忍冬藤與金銀花具有相近的化學成分和藥理活性[3]，均可做為臨床常用清熱解毒藥，而且還作為提取綠原酸的工業原料，用量較大，價格較高，貨源較緊。因此從忍冬藤中提取綠原酸應用于臨床和市場迫在眉睫。目前對忍冬藤的研究報道主要集中在化學成分、藥理作用等方面，對其有效成分提取方法的系統性研究較少，這直接影響到忍冬藤的開發與利用。因此，本文根據忍冬藤中綠原酸提取方法的一些前期研究，以綠原酸含量為指標，采用正交設計法對忍冬藤中綠原酸的微波和超聲提取工藝進行研究，旨在為更好的開發利用忍冬藤打下基礎。

1　材料

忍冬藤(采自大連大學藥植園)，經大連大學醫學院中藥學研究所鑒定為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥莖枝；綠原酸對照品(批號：110753-201213)，購自中國藥品生物制品檢定所。

HITACHI L2000型高效液相色譜儀(HITACHI L-2013送液泵，HITACHI UV-detector 2-2400檢測器)；甲醇(Tedia.)，乙腈(Tedia.)為色譜純，其他試劑為分析純。

2　方法

2.1HPLC色譜條件色譜柱：Hypersil Gold柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：327 nm；流動相：乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)。

2.2對照品溶液的制備精密稱取綠原酸對照品2.6 mg，用50%甲醇定容于50 mL的容量瓶中，搖勻，置冰箱內保存備用。

2.3微波提取試驗[4-8]取忍冬藤粉末(過三號篩)各1 g精密稱定，按實驗設計(見表1)進行微波提取，得到9組提取液，冷卻后過濾，取續濾液5 mL置25 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，搖勻，靜止，上清液用0.45 μm濾膜濾過即可。

2.4超聲波提取試驗[9-12]取忍冬藤粉末(過三號篩)各1 g精密稱定，按實驗設計(見表2)進行超聲波提取，得到9組提取液，冷卻后過濾，取續濾液5 mL置25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，靜止，上清液用0.45 μm濾膜濾過即可。

表1　微波法正交試驗因素水平表

表2　超聲波法正交試驗因素水平表

2.5線性關系考察精密吸取綠原酸標準品溶液3、5、10、15、20 μL，注入高效液相色譜儀，以乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)為流動相，按上述色譜條件測定峰面積，以對照品的含量為橫坐標，對照品峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線，計算回歸方程：Y=3E+06X+7276，R2=0.9992(n=5)，表明綠原酸在0.15～1.04 μg范圍內呈線性關系。

2.6精密度試驗在規定色譜條件下精密吸取同一濃度的對照品溶液10 μL，連續進樣6針，計算，RSD=1.05%。

2.7重現性試驗稱取供試品0.5 g，共6份，精密稱定后，依法測定綠原酸含量，RSD=1.12%(n=6)。

2.8穩定性試驗在規定色譜條件下，精密稱取同一樣品溶液10 μL，于0、2、4、8、12、24 h進樣，測定，計算含量，RSD=1.32%(n=6)結果表明綠原酸在避光條件下放置24 h基本穩定。

2.9加樣回收率試驗取已知含量的忍冬藤藥材，加入一定量綠原酸標準品，按上述色譜條件測定，計算回收率。測得平均回收率為99.1%，RSD=1.8%(n=6)。

2.10樣品測定以乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)為流動相，按照上述色譜條件，測定不同提取方法提取的忍冬藤中綠原酸的含量。

2.11統計學方法采用SPSS 11.5統計軟件對所得實驗數據進行正交實驗方差分析。

3　結果

3.1微波提取法從表3和表4中可以看出，各因素對綠原酸影響的順序為A>C>B。以綠原酸含量為指標得出的最佳工藝條件是A1B3C3，即提取時間為60 s，乙醇濃度為50%，料液比為1∶15，綠原酸含量為0.357%。

表3　微波提取法L9(33)試驗數據表

表4　微波提取法綠原酸含量方差分析表

注：在試驗水平α=0.05(或0.01)的情況下,分別檢驗各因素的顯著性,如果Fi>F0.05(i=A,B,C),即認為該因素對試驗指標有顯著影響，反之沒有顯著影響。經查表得F0.05=19。

3.2超聲波提取法從表5和表6中可以看出，各因素對綠原酸影響的順序為A>C>B。以綠原酸含量為指標得出的最佳工藝條件是A2B1C2，即甲醇濃度為50%，超聲功率為50W，料液比為1∶20，綠原酸含量為0.321%。

3.3不同提取工藝的對比分析在上述正交實驗的基礎上，分別在微波提取法和超聲提取法中篩選出綠原酸含量最高的一組進行比較，得出最佳提取工藝為微波提取法提取時間為60s，乙醇濃度為50%，料液比為1∶15，綠原酸含量為0.357%。

表5　超聲波提取法L9(33)試驗數據表

表6　超聲波提取法綠原酸含量方差分析表

注：在試驗水平α=0.05(或0.01)的情況下,分別檢驗各因素的顯著性,如果Fi>F0.05(i=A,B,C),即認為該因素對試驗指標有顯著影響,反之沒有顯著影響。經查表得F0.05=19。

表7　微波提取法與超聲提取法提取工藝對比分析表

4　討論

本實驗在前期預試驗及相關文獻的基礎上,進行了正交試驗因素水平的設置,選擇了最為影響微波提取法和超聲波提取法工藝的主要條件，進行了正交試驗，從實驗結果來看，所選擇的實驗條件能夠篩選出微波提取法和超聲波提取法的最佳提取工藝，為后續實驗提供方法和參考。

本實驗中兩種提取方法的最佳提取工藝在綠原酸含量上接近，但微波提取法具有熱效率高、設備簡單、適用范圍廣、重現性好、節省試劑、污染小等特點，從提取溶劑上來講，本實驗采用乙醇作為綠原酸的微波提取溶劑，結果表明乙醇能夠較完全的提取藥材中的綠原酸成分，并且乙醇與甲醇相比，具有污染小，價格便宜等優點，甲醇比乙醇揮發快，毒性大，工業上大量提取不宜采用。同時，微波提取工藝可有效地克服傳統煎煮提取方法中藥材細粉易出現糊化、堵塞等問題，適宜于工業化大生產[13-15]。所以本實驗初步認為微波提取法可作為忍冬藤的最佳提取工藝，具體方法有待于進一步研究。

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(2015-07-17收稿責任編輯：張文婷)

Optimization of Extraction Process of Chlorogenic Acid in Lonicerae japonicae Caulis by Orthogonal Design

Mao Ying, Li Dongxia, Xia Chunli

(MedicalCollege,DalianUniversity,Dalian116622,China)

Objective: To study the extraction methods for chlorogenic acid in Lonicerae japonicae Caulis. Methods: The microwave extraction and ultrasonic extraction of chlorogenic acid in Lonicerae japonicae Caulis were set based on orthogonal design. The chlorogenic acid contents of different extraction techniques were detected by HPLC. The results of the two extraction methods were compared. Results: The results show that the chlorogenic acid was highest, up to 0.357%, when microwave time was set at 60s with 50% ethanol concentration and solid-liquid ratio of 1∶15 by microwave extraction. The chlorogenic acid was highest when methanol concentration, up to 0.321%, was set at 50%, ultrasonic power 50W and solid-liquid ratio 1:20 by ultrasonic extraction. By taking chlorogenic acid content as an indicator, microwave extraction method was better than ultrasonic extraction. Conclusion: According to the results, the best extraction method for Chlorogenic acid in Lonicerae japonicae Caulis was microwave extraction with less time cost and low energy consumption and the extraction rate is better than that of the ultrasonic extraction. It can be applied in the extraction of chlorogenic acid in Lonicerae japonicae Caulis.

Lonicerae japonicae Caulis; Chlorogenic acid; Orthogonal design; Extraction methods; Determination

遼寧省大連市科技計劃項目(編號：2008E11SF171)

毛瑩(1982.01—)，女，博士研究生，研究方向：中藥鑒定方法學、中藥藥效組分及藥效組分質量評價體系研究，E-mail:maoyingying2004@sina.com

R284.2

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.049