TTN、ALK、MUC2高頻變異位點與胃癌臨床病理特征的相關性

王珍珍，王公平，張 偉，裴 哲

TTN、ALK、MUC2高頻變異位點與胃癌臨床病理特征的相關性

王珍珍，王公平，張 偉，裴 哲

目的 研究胃癌的高頻變異位點并探討其與胃癌臨床病理特征的關系。方法 通過二代測序平臺對26例胃癌組織進行靶向深度測序，與人類基因組UCSC hg19數據庫比對，篩選出胃癌中的高頻變異位點，并對臨床病理特征進行分析。結果 胃癌中突變率較高的基因位點有TTNrs12693166 (15/26) 、rs2627043 (22/26) ，ALKrs3795850 (19/26) 、rs1881420 (23/26) ，MUC2 rs2856111(20/26) 、rs56365200 (20/26)。高頻變異位點與胃癌的年齡、性別、分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期以及勞倫斯分型等臨床病理特征之間差異無統計學意義。結論TTNrs12693166、rs2627043、ALKrs3795850、rs1881420、MUC2 rs2856111、rs56365200位點在胃癌中變異頻率較高，可能與胃癌的發生存在一定的相關性。未發現高頻變異位點與胃癌患者的臨床病理特征存在明顯的相關性。

胃癌；測序分析；高頻變異位點；臨床病理特征

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，發病率居全球第四位，在癌癥引起的死亡中致死率居第二位[1]。在中國，男性胃癌發病率居第二位，死亡率居第三位；女性胃癌發病率居第四位，死亡率居第二位，嚴重影響人們的生命健康和生活質量[2]。胃癌的發生是一個多因素、多環節、多個基因共同參與的復雜過程。其中，關于胃癌基因檢測的研究已成為國內外胃癌研究的一個熱點，并且已取得了一定的進展[3]。隨著二代測序技術的出現，可以對癌癥中基因組、轉錄組及外顯子組進行更全面的深度測序，為對癌癥更精確地診斷和分類、進行個體化治療、合理預后評估及靶向抗癌藥物的研發提供一定的參考[4]。

本研究通過二代測序平臺對26例胃癌組織進行靶向深度測序，通過與人類基因組UCSC hg19數據庫的比對，篩選胃癌患者中變異基因，探討高頻變異位點在胃癌中的臨床病理意義，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 ―般資料 收集2013年4月至9月在河南科技大學第一附屬醫院胃腸腫瘤外科住院進行手術的胃癌患者術后標本，-80 ℃超低溫冰箱保存。入選患者術前均未經過放療或化療，術前由胃鏡及活檢組織病理診斷，并且術后病理檢驗確認。胃癌臨床病理分期依據美國癌癥聯合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)胃癌TNM分期標準[5]進行分期。26例胃癌患者的中位年齡為58.5歲(39～78歲)，其中男性19例(73.1%)，女性7例(26.9%)；高分化5例，中分化7例，低分化14例；淋巴結轉移者20例，無淋巴結轉移者6例。本研究經河南科技大學第一附屬醫院倫理委員會許可，采樣患者均知情同意。

1.2 測序實驗步驟如下

1.2.1 樣本制備 冷凍的腫瘤組織用QIAGEN公司的基因組DNA提取試劑盒，按照說明書進行DNA的提取后定量備用。

1.2.2 文庫構建 將基因組DNA通過超聲波隨機打斷成長度為數十至數百堿基的片段，在這些片段的兩端添加上不同的接頭，通過變性得到單鏈模板文庫，然后再通過接頭固定在相應的固定相上。

1.2.3 測序反應 DNA測序運用Illumina公司Hiseq 2500進行測序，向反應體系中同時添加DNA聚合酶、接頭引物和帶有堿基特異熒光標記的4種dNTP。這些dNTP的3’-OH被化學方法所保護，因而每次只能添加一個dNTP。在dNTP被添加到合成鏈上后，所有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶會被洗脫掉。加入激發熒光所需的緩沖液后，激光激發熒光信號，并由光學設備完成熒光信號的記錄，利用計算機分析將光學信號轉化為測序堿基。熒光信號記錄完成后，淬滅熒光信號并去除dNTP 3’-OH保護基團，以便進行下一輪的測序反應。

1.2.4 數據分析 首先將原始數據進行過濾，過濾掉含有接頭及低質量的讀長，得到有效數據。將有效數據通過伯羅斯—惠勒變換(Burrows-Wheeler Aligner，BWA)方法比對到參考基因組(UCSC hg19)，得到最初比對結果。再用Picard和GATK軟件進行去重復、局部重對比、堿基質量值校正等處理，得到最終的比對結果。用GATK的Unified Genotyper模塊進行SNV/InDel檢測。臨床病理資料的統計分析：運用SPSS 21.0統計軟件，采用Fisher精確概率法對高頻變異位點與胃癌臨床病理特征進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 測序發現的高頻變異位點 經過篩選過濾發現，突變率較高的基因位點有TTNrs12693166 (15/26)、TTNrs2627043 (22/26)、ALKrs3795850 (19/26)、ALKrs1881420 (23/26)、MUC2 rs2856111(20/26)、MUC2 rs56365200 (20/26)，詳見圖1。

圖1 胃癌中的高頻變異位點分布

2.2 高頻變異位點與胃癌臨床病理特征的相關性TTNrs12693166、rs2627043，ALKrs3795850、rs1881420，MUC2 rs2856111、rs56365200位點的變異與胃癌患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期以及勞倫斯分型之間均無統計學意義(均P>0.05)，詳見表1。

表1 TTN、ALK、MUG2變異位點與胃癌臨床病理特征的關系(n=26) 例

(續表)

臨床特征TTNrs12693166TTNrs2627043ALKrs3795850ALKrs1881420MUC2rs2856111MUC2rs56365200變異未變異變異未變異變異未變異變異未變異變異未變異變異未變異性別 男127172145163154136 女345252705270分化程度 高分化233241503250 中分化527043706161 低分化8612211311311395浸潤深度 T1/T2526152704370 T3/T4109163145163163136淋巴結轉移 有119182155173164155 無424242604251TNM分期 Ⅰ/Ⅱ738264917391 Ⅲ/Ⅳ88142133142133115勞倫斯分型 彌散型104131122113122113 混合型223131402222 腸型356244806271

注：P<0.05，有統計學意義。

3 討論

目前，胃癌基因檢測的研究已成為國內外胃癌研究的熱點之一，并且已取得了一定的進展。與第一代測序技術相比，二代測序技術因其高通量、快速、低成本的優點，保持了較高的準確度，加快了測序速度，很大程度上降低了測序的成本，在基因組學研究中已得到廣泛應用[6]。二代測序能夠系統地檢測腫瘤基因組中的基因變異，并發現新的基因變異[7]。運用二代測序發現與腫瘤相關的基因變異能夠為腫瘤發病風險預測、早期診斷、效果評估、個體化醫療的發展提供一定的理論基礎，為人們進一步了解腫瘤發病機制、篩選有效的腫瘤標記物以及對基因組學的深入研究提供了有效途徑[8]。

通過二代測序技術發現本研究中的26例胃癌組織中，TTN基因、ALK基因以及MUC2基因突變率較高，而突變率較高的基因位點有TTNrs12693166 (15/26)、TTNrs2627043 (22/26)、ALKrs3795850 (19/26)、ALKrs1881420 (23/26)、MUC2 rs2856111(20/26)、MUC2 rs56365200 (20/26)。TTN基因編碼肌聯蛋白，負責調節肌肉的被動彈性，在心肌和骨骼肌的發育、結構形成、功能調節中發揮關鍵作用，與肌動蛋白和肌球蛋白共同構成了人體心肌和骨骼肌的重要組成部分[9]。Pf?hler等[10]研究發現TTN作為存在于黑色素瘤相關性視網膜病患者的血清抗體中的抗原，是黑色素瘤潛在的生物標記，可能具有致癌作用。ALK基因編碼間變性淋巴瘤受體酪氨酸激酶，作為核仁磷酸蛋白的融合伴侶首次發現于間變性大細胞淋巴瘤[11]。Chou等[12]發現2.2%的乳頭狀甲狀腺癌中存在ALK基因的易位，并且ALK基因的重排可能與乳頭狀甲狀腺癌的彌漫性硬化相關。Demeure等[13]發現在乳頭狀甲狀腺癌中ALK和EML4的融合可導致ALK的連續性激活，形成腫瘤生長及存活的通路，是腫瘤發生過程中的驅動事件。

Lee等[14]運用熒光原位雜交技術以及二代測序技術檢測了ALK在結直腸癌中的重排，發現ALK重排是結直腸癌中潛在的活化驅動變異。MUC2基因能夠編碼黏蛋白，其主要表達于黏膜上皮，屬于黏膜防御機制的一道屏障。MUC2基因水平的變化可能會導致黏蛋白表達的異常，從而導致一系列病理生理變化。Marín等[15]研究發現MUC2的基因變異與胃癌前病變，特別是攜帶有幽門螺桿菌感染的患者，存在明顯相關性。正常胃黏膜很少或不表達MUC2，當腸化生或者胃癌時MUC2的表達水平明顯增加[16-17]。MUC2可能是在幽門螺桿菌感染后由促炎因子的表達所激活，從而導致MUC2的過量表達[18]。因此，TTN、ALK、MUC2可能存在與胃癌相關的基因變異，這些位點可能與胃癌的發生、發展存在一定的聯系。

然而，將這些高頻突變位點與胃癌臨床病理特征進行分析，并未發現這些位點的變異與胃癌患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期以及勞倫斯分型等臨床病理特征存在明顯的相關性。鑒于本研究樣本量較少，這些高頻變異與胃癌發生發展的相關性有待于進一步證實。

綜上，TTNrs12693166、rs2627043、ALKrs3795850、rs1881420、MUC2 rs2856111、rs56365200位點在胃癌中變異頻率較高，可能與胃癌的發生存在一定的相關性。本研究未發現這些變異位點與胃癌患者的臨床病理特征存在明顯的相關性，尚需進一步大樣本研究證實。

[1]Yamamoto H,Watanabe Y,Maehata T,et al.An updated review of gastric cancer in the next-generation sequencing era: insights from bench to bedside and vice versa[J].World J Gastroenterol,2014,20(14):3927-3937.

[2] Chen W,Zheng R,Zeng H,et al.The updated incidences and mortalities of major cancers in China,2011[J].Chin J Cancer,2015,34(11):502-507.

[3] Lin Y, Wu Z, Guo W,et al.Gene mutations in gastric cancer:a review of recent next-generation sequencing studies[J].Tumor Biol,2015,36(10):7385-7394.

[4] Behjati S,Tarpey PS.What is next generation sequencing[J].Arch Dis Child Educ Pract Ed,2013,98(6):236-238.

[5] Fang WL,Huang KH,Chen JH,et al.Comparison of the survival difference between AJCC 6th and 7th editions for gastric cancer patients[J].World J Surg, 2011,35(12):2723-2729.

[6]肖嵐.新一代測序技術及其在腫瘤研究中的應用[J].國際病理科學與臨床雜志,2013,33 (4):322-326.

[7]Meyerson M,Gabriel S,Getz G.Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing[J].Nat Rev Genet,2010,11(10):685-696.

[8] Lin E,Chien J,Ong FS,et al.Challenges and opportunities for next-generation sequencing in companion diagnostics[J].Expert Rev Mol Diagn,2015,15(2):193-209.

[9]Vikhlyantsev IM,Podlubnaya ZA.New titin (connectin) isoforms and their functional role in striated muscles of mammals: facts and suppositions[J].Biochemistry (Mosc),2012,77(13):1515-1535.

[10]Pf?hler C,Preuss KD,Tilgen W,et al.Mitofilin and titin as target antigens in melanoma-associated retinopathy[J].Int J Cancer, 2007,120(4):788-795.

[11]Morris SW,Kirstein MN,Valentine MB,et al.Fusion of a kinase gene, ALK, to a nucleolar protein gene, NPM, in non-Hodgkin′s lymphoma[J].Science,1994,263(5151):1281-1284.

[12]Chou A,Fraser S,Toon CW,et al.A detailed clinicopathologic study of ALK-translocated papillary thyroid carcinoma[J].Am J Surg Pathol,2015,39(5):652-659.

[13]Demeure MJ,Aziz M,Rosenberg R,et al.Whole-genome sequencing of an aggressive BRAF wild-type papillary thyroid cancer identified EML4-ALK translocation as a therapeutic target[J].World J Surg,2014,38(6):1296-1305.

[14]Lee J,Kim HC,Hong JY,et al.Detection of novel and potentially actionable anaplastic lymphoma kinase (ALK) rearrangement in colorectal adenocarcinoma by immunohistochemistry screening[J].Oncotarget,2015,6(27):24320-24332.

[15]Marín F,Bonet C,Muoz X,et al.Genetic variation in MUC1, MUC2 and MUC6 genes and evolution of gastric cancer precursor lesions in a long-term follow-up in a high-risk area in Spain[J].Carcinogenesis,2012,33(5):1072-1080.

[16]Babu SD,Jayanthi V,Devaraj N,et al.Expression profile of mucins (MUC2, MUC5AC and MUC6) in Helicobacter pylori infected pre-neoplastic and neoplastic human gastric epithelium[J].Mol Cancer,2006,5:10.

[17]Reis CA,David L,Carvalho F,et al.Immunohistochemical study of the expression of MUC6 mucin and co-expression of other secreted mucins (MUC5AC and MUC2) in human gastric carcinomas[J].J Histochem Cytochem,2000,48(3):377-388.

[18]Mejías-Luque R,Lindén SK,Garrido M,et al.Inflammation modulates the expression of the intestinal mucins MUC2 and MUC4 in gastric tumors[J].Oncogene,2010,29(12):1753-1762.

Correlation betweenTTN,ALK,MUC2 Recurrent Mutation Sites and Clinicopathologic Characteristics in Gastric Cancer

WANG Zhen-zhen, WANG Gong-ping, ZHANG Wei, PEI Zhe

(College of Clinical Medicine, First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo study the recurrent mutation sites in gastric cancer and explore its relation to clinicopathologic significance of gastric cancer.MethodsNew generation sequencing was applied to 26 cases of gastric cancer tissues by the targeted deep sequencing. The sequencing data were compared with UCSC hg19 database, and the recurrent mutation sites were screened and analyzed with the clinicopathologic features of gastric cancer.ResultsThe recurrent mutation sites in gastric cancer wereTTNrs12693166(15/26),TTNrs2627043(22/26),ALKrs3795850(19/26),ALKrs1881420(23/26),MUC2 rs2856111(20/26),MUC2 rs56365200(20/26). There were no statistical significance between these recurrent mutation sites and the clinicopathological features in patients with gastric cancer.ConclusionThe recurrent mutation sites (TTNrs12693166, rs2627043,ALKrs3795850, rs1881420,MUC2 rs2856111, rs56365200) might be correlated with the carcinogenesis of gastric cancer. No significant association were found between these recurrent mutation sites and the clinicopathological features in patients with gastric cancer.

gastric cancer；sequencing analysis；recurrent mutation sites； clinicopathological characteristics

1672-688X(2016)04-0255-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.005

2016-05-17

河南科技大學臨床醫學院，河南科技大學第一附屬醫院，河南洛陽 471003

王珍珍(1989- )，女，河南平頂山人，從事胃癌的基礎研究與臨床治療工作。

王公平，男，博士，教授，E-mail：wgpnw@126.com

R735.2

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