溪黃草抗乙型肝炎病毒體外抑制作用研究

龐瓊，胡志立（.郴州市疾病預防控制中心體檢科，湖南423000；2.湘南學院胃腸外科，湖南郴州423000）

·論著·

溪黃草抗乙型肝炎病毒體外抑制作用研究

龐瓊1，胡志立2△
（1.郴州市疾病預防控制中心體檢科，湖南423000；2.湘南學院胃腸外科，湖南郴州423000）

目的為證實溪黃草單味藥具有體外抗乙型肝炎病毒活性提供重要的科學依據。方法將溪黃草50%乙醇提取物配置成一定藥物濃度，擬采用HepG2.2.15細胞模型進行細胞毒試驗和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）酶聯免疫檢測。結果半數細胞抑制時其濃度為4.275mg/mL，溪黃草粗提物對HBsAg的半抑制濃度（IC50）為2.250mg/mL，對HBeAg的IC50為2.150mg/mL，治療指數小于2。結論溪黃草粗提物具有抑制體外乙型肝炎病毒的作用。

溪黃草；肝炎病毒，乙型；細胞培養技術；植物，藥用；細胞毒性試驗，免疫

【Abstract】Objective To provide an important scientific basis for verifying the in vitro anti-HBV activity of single herb Rabdosia Serra.M ethods 50% ethanolextract of Rabdosia Serra was dispensed ascertain concentrations.The HepG 2.2.15 cellularmodel was adopted to conduct the cellular toxicity testand HBs Ag and HBe Ag enzyme-linked immunosorbentssay（ELISA）. Results IC50was 4.275mg/mL，IC50of crude extract of Rabdosia Serra on HBs Ag was 2.250mg/mL，which on HBe Ag was 2.150 mg/mL，the therapeutic index（TI）＜2.Conclusion The crude extract of Rabdosia Serra has the effect for in vitro inhibiting HBV.

【Key words】Isodon striatus；Hepatitis B virus；Cell culture techniques；Plants，medicinal；Cytotoxicity tests，immunologic

目前，乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行趨勢，據世界衛生組織報道，全球約20億人曾感染HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者［1］。2006年全國乙型肝炎血清流行病學調查表明，我國1～59歲人群乙型肝炎表面抗原（HBsAg）攜帶率為7.18%［2-3］。據此推算，我國有慢性HBV感染者約9 300萬人，其中慢性CHB患者約2 000萬例［4］。我國是乙型肝炎大國，因此，國家將乙型肝炎藥物的研發作為重點研究項目。溪黃草屬唇形科香茶菜屬，多年生草本植物，香茶菜屬植物在民間做藥用，功效之一即為能夠治療各種肝炎。到目前為止，大多數對溪黃草的研究集中在對其化學成分的分離與鑒定上，而抗乙型肝炎的實驗研究較少，對HBV的體外抑制作用的實驗研究更少，且大部分是采用以溪黃草為主的復方制劑為研究對象，因此，該實驗研究溪黃草單味藥體外抗HBV活性部位有利于深度開發溪黃草。該研究用HepG2.2.15作為細胞模型，將溪黃草50%乙醇提取物配置成一定藥物濃度，進行體外抑制HBV試驗。

1　材料與方法

1.1材料溪黃草（購自長沙市中藥大市場），乙醇（國產分析純），HepG2.2.15細胞（購自中南大學細胞培養中心），RPMI1640干粉，胎牛血清，G-418（Geneticin），谷氨酰胺，青鏈霉素（雙抗），RPMI1640培養液，噻唑藍（MTT）反應液，細胞消化液（0.25%胰酶），HBV表面抗原診斷試劑盒（酶聯免疫法），乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）診斷試劑盒（酶聯免疫法），HBV核酸擴增（HBV PCR）熒光檢測試劑盒，氨水，阿昔洛韋片（0.1 g/片）；CO2細胞培養箱，倒置顯微鏡，離心機（KA-1000型），超凈工作臺（YJ-875型），生化培養箱（SP-01型），艾科浦純水機（AFX-Z-1001-P型），恒溫水浴箱（HWS-26型），酶標儀，熒光定量PCR儀，培養瓶，96孔板。

1.2方法

1.2.1HepG2.2.15細胞株的培養、凍存、復蘇。

1.2.2藥物的配制選取溪黃草50%乙醇提取物，阿昔洛韋分別用0.1%二甲基亞砜（DMSO）溶解，配成一定濃度；5%NaHCO3、1mol/LHCl調pH值至6.8～7.2，0.25μm針頭過濾器過濾后備用。

1.2.3細胞毒性測定HepG2.2.15細胞用0.25%胰蛋白酶消化液消化成單個細胞，吹打均勻后接種于96孔板，每孔細胞數2×104個，37℃，5%CO2孵箱培養24 h，待細胞貼壁后加含不同濃度藥物的培養液。溪黃草提取物3 g，用100mL的0.1%DMSO稀釋成30mg/mL制成儲備液，再用0.1%DMSO稀釋成2.5、3.5、4.0、4.5、5.0mg/mL 5個濃度，每孔20μL加于96孔板，每濃度4孔，分別在3、6、9 d換同濃度藥液，設無藥物細胞對照組和培養液空白對照組及阿昔洛韋陽性對照組，作用9 d后顯微鏡下觀察細胞生長狀態。吸取上清用于抗原檢測，每孔加入100μL培養液，加入10μL濃度為5mg/mL的噻唑藍（MTT）；在37℃，5%CO2培養箱內培養4 h，可見紫黑色顆粒，棄去培養液及MTT液，每孔加入DMSO 150μL，振蕩后顆粒溶解，用酶聯免疫檢測儀測450 nm光密度（OD）值OD450。

1.2.4對HepG2.2.15細胞HBsAg、HBeAg合成分泌的抑制實驗用0.1%DMSO稀釋成0.3、0.8、1.0、2.0、2.5mg/mL 5個濃度，設無藥物細胞對照組和培養液空白對照組，阿昔洛韋陽性對照組，作用9 d后檢測細胞培養上清中HBsAg、HBeAg抗原含量。每孔加入待測標本（即上清培養液）50μL，再將每孔中加入酶結合物50μL（空白對照組除外），充分混勻后封板，置37℃孵育8 h。手工洗板，棄去孔內液體，洗滌液儲滿各孔，靜置5 s后甩干，重復5次后拍干。每孔加入顯色板A、B液各50μL，充分混勻，封板，置37℃孵育15min。最后，每孔加入終止液50μL，混勻。用酶標儀測定，先用空白孔校零，然后讀取450 nm處各孔OD值。當日不進行測定的細胞培養上清，需放置在-20℃保存。

1.2.5對HepG2.2.15細胞HBV DNA合成分泌的抑制實驗對抗原檢測確實有效的藥物，留存細胞培養上清。采用HBVPCR熒光檢測試劑盒，檢測細胞培養上清中HBV DNA含量。具體操作，取9 d的上清合并液加等量DNA提取液打勻，沸水浴10 min（誤差不超過1min），轉至4℃靜置8～12 h以保證病毒顆粒充分裂解。10 000 r/min離心5min，取上清保存DNA于-20℃備用。提取上清液中的DNA加入HBVDNA PCR熒光檢測試劑盒中的PCR反應管（已加入HBV DNA特異性引物、一條HBVDNA特異性熒光探針、耐熱Taq DNA聚合酶、4種核苷酸單體dNTPs，PCR反應液）。用ABI7000實時定量檢測。

1.3統計學處理應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1細胞毒實驗結果細胞抑制百分率（%）=［（細胞對照OD450值-加藥組OD450值）/（細胞對照OD450值-空白OD450）］×100%。TC50：以細胞抑制率對藥物濃度用Origin軟件擬合，若曲線形狀為典型的S型濃度-效應曲線，可得到抑制細胞生長50%時所需藥物濃度，即TC50。取儲備液稀釋成2.5、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/mL 5個濃度，作用于HepG2.2.15，MTT實驗后，經計算得抑制率分別為1.0%、7.2%、21.0%、56.0%、60.3%，經Origin軟件擬合，其半數細胞抑制時其濃度為4.275mg/mL，即TC50為4.275 mg/mL，陽性對照組的TC50為0.370mg/mL。

2.2抗原分泌抑制實驗結果抗原抑制率（%）=［（細胞對照OD450-加藥組OD450值）/（細胞對照組OD450-空白OD450）］×100%。將藥物濃度與抑制率輸入軟件，通過量效關系來擬合曲線，從而推算出半抑制濃度（IC50），即半數有效濃度，也是抑制抗原分泌達50%時所需的藥物濃度。溪黃草50%提取物有抗HBV活性。在無毒濃度2.5 mg/mL時對HepG2.2.15分泌HBsAg的抑制率為51.8%；對HBeAg的抑制率為53.4%。經Origin軟件S曲線擬合，溪黃草粗提物對HBsAg的IC50為2.25mg/mL，對HBeAg的IC50為2.15mg/mL。見表1、2。

表1　溪黃草50%乙醇提取物對HepG2.2.15分泌HBsAg的抑制情況

表2　溪黃草50%乙醇提取物對HepG2.2.15分泌HBeAg的抑制作用

2.3TI TI=TC50/IC50當TI＜1.0表明受試樣品為無效；1～2為低效有毒，即弱陽性；＞2～＜10為有效低毒，即陽性；≥10為高效低毒，即強陽性。根據細胞毒實驗，及體外乙型肝炎抗原分泌抑制實驗，計算得到溪黃草50%提取物對HBsAg的治療指數為1.90；對HBeAg的治療指數為1.99。因此，為有效低毒。陽性對照組HBeAg的IC50為7.750mg/mL，TI為0.048＜2；HBsAg的IC50為0.001 mg/mL，TI為328.472＞2。

2.4對HepG2.2.15細胞合成HBVDNA作用結果為進一步確證溪黃草50%提取物的抗病毒作用，采用熒光定量PCR方法檢測細胞培養上清中HBV DNA含量。即濃度為0mg/mL，DNA拷貝數為280×103；濃度為0.5mg/mL，DNA拷貝數為190×103；濃度為1.0mg/mL，DNA拷貝數為96×103；濃度為2.0mg/mL，DNA拷貝數為57×103；濃度為2.5mg/mL，DNA拷貝數為22×103。

溪黃草粗提物對HepG2.2.15細胞分泌HBV DNA有抑制作用，且隨濃度的增加，細胞培養上清中HBVDNA含量減少，呈劑量依賴關系，見圖1。溪黃草50%提取物對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg、HBeAg均有抑制作用，且呈劑量-效應依賴關系。陽性對照組僅對HBsAg有抑制作用。從以上抑制抗原及HBV DNA的實驗可以看出，溪黃草50%乙醇提取物具有抗HBV的活性，因此，可將溪黃草50%乙醇的提取物繼續進行下一步的分離。3討論

圖1　溪黃草95%提取物抑制HBVDNA分泌活性檢測情況

目前治療HBV以干擾素及核苷類似物為主，而其均具有一定的使用局限性。比如干擾素-α（INF-α），來源于宿主細胞對病毒發生免疫應答而產生的蛋白質，既有免疫調節作用，又有抗病毒的作用。但由于其不良反應明顯，可加重某些免疫性疾病，而且高病毒載量者應答率低，因此，INF-α的使用受到一定的限制［5］。

我國天然植物資源豐富，從中找到了抗HBV的天然有效成分，具有極其重要的社會意義和經濟意義。目前已研制出以溪黃草為組方的保健產品，溪黃草茶已在市場上廣泛應用［6］。臨床上已將溪黃草用于治療HBV，例如使用新鮮溪黃草汁（溪黃草I.Prrd）加蜜糖口服，治療臨床診斷的HBV［7］，采用自擬蛇參虎溪湯治療HBV，總有效率達83.8%［8］。還有研究者做過溪黃草的復方制劑對HBV的體外抑制作用，發現十味溪黃草顆粒在HepG2.2.15細胞培養中對HBsAg、HBeAg的分泌有顯著的抑制作用［9］。由此看來，從民間藥用到臨床使用再到藥物實驗室基礎研究，都為溪黃草抗HBV作用提供了初步證據。本研究將單味溪黃草藥物作為研究對象，進行抗HBV體外抑制研究，具有新的研究價值，為開發中草藥治療HBV提供科研依據。

血清HBsAg定量檢測可用于預測疾病進展、抗病毒療效和預后［10-11］。因此，本研究選取了HBsAg、HBeAg進行酶聯免疫檢測。而HBVDNA定量檢測主要用于判斷慢性HBV感染的病毒復制水平，可用于抗病毒治療適應證的選擇及療效的判斷。因此，本實驗采用靈敏度和精確度高的PC R法來測定HBV DNA。

雖然本研究證實了單味溪黃草具有體外抗HBV的作用，但藥物進入體內后，要進行復雜的代謝，產生一些新的有效成分，也可能有些有效成分會被滅活，或體內、體外有效的藥物濃度會存在較大差距，為進一步驗證溪黃草抗HBV的作用，下一步還應當進行體內實驗。

綜上所述，溪黃草50%乙醇提取物具有體外抗HBV的活性，因此，可將溪黃草50%乙醇的提取物繼續進行下一步的分離，為篩選溪黃草體外抗HBV活性部位提供素材。

［1］Ott JJ，Stevens GA，Groeger J，etal.Globalepi demiology of hepatitis B virus infection：new estimates of age-specific HBsAg seroprevalence and ende micity［J］.Vaccine，2012，30（12）：2212-2219.

［2］Liang X，BiS，YangW，etal.Epide miological serosurvey of hepatitis B in China—declining HBV prevalence due tohepatitis B vaccination［J］.Vaccine，2009，27（47）：6550-6557.

［3］Liang X，BiS，YangW，etal.Evaluation of the impactof hepatitis B vaccination among children born during1992-2005 in China［J］.JInfect Dis，2009，200（1）：39-47.

［4］Lu FM，ZhuangH.Management o fhepatitisB in China［J］.ChinMed J（Engl），2009，122（1）：3-4.

［5］Jassim SA，NajiMA.Novelanti viralagents：amedicinalplant perspective［J］. JAppl Microbiol，2003，95（3）：412-427.

［6］呂惠珍.廣西香茶菜屬藥用植物資源及其開發利用前景［J］.時珍國醫國藥，1999，10（9）：732.

［7］吳劍峰.溪黃草的研究綜述［J］.時珍國醫國藥，2003，14（8）：498-450.

［8］莫激勤．蛇參虎溪湯治療乙型肝炎68例［J］.陜西中醫，1997，18（7）：293.

［9］謝華娣，陳鴻珊.十味溪黃草顆粒對乙型肝炎病毒的體外抑制作用［J］.廣東藥學，2004，14（6）：60-63.

［10］Lampertico P，MainiM，Papatheo doridisG.Optimal management of hepatitis B virus infection-EASL Special Conference［J］.J Hepatol，2015，63（5）：1238-1253.

［11］Liaw YF，Kao JH，Piratvisuth T，etal.Asian-Pacific consensus statement on the management of chronic hepatitis B：a 2012 update［J］.Hepatol Int，2012，6（3）：531-561.

Study on in vitro inhibiting effect of Rabdosia Serra in anti-HBV

Pang Qiong1，Hu Zhili2△
（1.Chenzhou Municipal Center

for Disease Control and Prevention，Chenzhou，Hunan 423000，China；2.Department of Gastroent erological Surgery，Affiliated Hospitalof Xiangnan College，Chenzhou，Hunan 423000，China）

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.10.010

A

1009-5519（2016）10-1465-03

龐瓊（1981-），碩士研究生，主治醫師，主要從事臨床及相關基礎研究工作。

△，E-mail：50381234@qq.com。

（2016-02-18）